糠醛降解特殊菌种的特性研究及其降解机理探讨

发布时间：2020-11-19 06:03

　　 皂素是以黄姜为原料来提取,因生产出300多种激素类药物而被称之为“医药黄金”。皂素生产工艺是将黄姜粉碎预发酵后,将全部浆料进行酸水解、过滤、水洗,得到渣料和废液。皂素生产企业产生的废水主要由脱酸水、洗姜漂洗过滤水、酒糟水组成。黄姜皂素生产废水,因其废水量大、浓度高、酸性强、盐度高,而被称之为“废水之王”,属于高难度难降解工业废水,其中有机污染物浓度也很高。据资料显示,皂素生产废水主要含有糖类、有机酸类、短链的醇、醛类、无机盐类、姜黄素等物质。其中的主要有机物是甲醇、乙醇、乙酸和醛类及其它挥发性物质。在前人的研究中发现,皂素废水中有机污染物以糠醛浓度最高。这是由于黄姜与甘蔗渣、花生壳、高梁杆、燕麦壳和玉米芯等农副产品相同,含有碳水化合物多缩戊糖,在酸的作用下,多缩戊糖先解聚变成戊醛糖,进一步脱水而成糠醛。糠醛是一种含有呋喃环的五碳杂环化合物,由戊糖脱水而得,对微生物的生长具有抑制甚至毒害作用。同时,糠醛被认为是一种杀虫剂。糠醛对动物的危害主要表现在刺激呼吸系统、神经系统、肝脏、脾脏和肾脏、血液系统等方面。因其在工业上具有广泛用途,随之在国民经济各个领域使用的日益扩大,导致进入环境总量日益增多,其对于环境生态的损害风险也在逐渐加大。由于糠醛在分子结构上含有呋喃环,不易受到代谢过程的破坏,表现出难以被生物降解的性能。糠醛及其衍生物被发现是皂素废水内几十种有机污染物之中浓度最高的。且糠醛浓度过高会对后续污水生化处理系统中的微生物起到极大的抑制甚至毒害作用。糠醛因其结构中具有亲电特性的羰基基团,能与细胞中的大分子物质如蛋白、核酸和脂质形成醛加合物,从而破坏这些大分子的功能和活性,对微生物具有极大的毒性。因而,在含较高浓度糠醛的废水处理中,传统的活性污泥法受到了极大的限制。同时,高浓度的糠醛对皂素废水的高COD是极大的贡献。微生物生物处理技术在治理难降解有机废水方面具有良好的应用,效果好,成本低,效率高,在环境保护领域作出了极大的贡献。利用能有效降解糠醛的微生物来处理皂素废水,不仅能降低皂素废水的COD,同时减轻糠醛及其衍生物对后续生化系统中微生物生长发育的抑制作用,提升生物降解的处理效率,对皂素废水达标排放具有重要的意义。本文围绕糠醛的微生物降解这一主题,对糠醛高效降解菌进行筛选鉴定、培养条件优化、降解产物分析、降解酶定位和利用糠醛降解菌处理含皂素废水等多个方面内容开展了研究,并对微生物降解糠醛的途径进行了初步推测。结果如下所述：1.糠醛降解菌的筛选鉴定及特性研究从皂素废水生化处理系统的活性污泥中以糠醛为唯一碳源,筛选到三株对糠醛具有一定耐受性并能有效降解高浓度糠醛的好氧细菌,利用形态观察、生理生化特性分析,综合运用Biolog细菌鉴定系统分析,结合16S rDNA测序分析和构建系统进化树等多种手段对这三株细菌进行了鉴定分析。将三株菌株分别命名为DS1、DS3和DS4,其中DS1菌落为圆形或近似圆形、质地软、无色素、不透明、稍有光泽,随培养时间增长,表面有红色产生：DS3菌落为圆形或近似圆形、不透明、乌白色或微黄色,随着培养时间增长,单个菌落表面的中间部分会逐渐形成皱醭。DS4菌落为表面圆形、不透明、浅黄色,表面光滑,边缘光滑平整。对三株菌株进行革兰氏染色、扫描电镜观察和平板培养,表明三株菌株均为杆状菌,其中菌株DS1和DS3为革兰氏阳性菌,菌株DS4为革兰氏阴性菌。将三株菌株DS1、DS3、DS4的16S rDNA序列提交Genbank进行登记,登记号分别为：HM773424、KJ641588和KJ641589。通过构建系统进化树确定三株菌株分别为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。同时对这三株菌株的生长特性和对糠醛的耐受性进行了研究分析。分别在添加糠醛和未添加糠醛条件下对三株细菌进行生长曲线实验,。当培养基中添加了糠醛后,三株菌株的生长速率明显减慢,延滞期增加。在添加了1000 mgL-1糠醛之后,DS1的延滞期由大约4h延长至8h；DS3的延滞期由大约4h延长至6h；DS4的延滞期由大约4h延长至12h。其中菌株DS3相对于其他2株菌株对糠醛的适应能力强,降解速率快。初步研究表明,这三株能以糠醛为唯一碳源的菌株对其耐受性分别达到了4000 mg L-1,6000mg L-1和 2000 mg L1,远远优于现有文献报道的其他菌株。这三株菌株的最适生长pH分别为7,8,9,最适生长底物浓度为1000 mg L-1、2000 mg L-1和2000 mg L-1。2.糠醛降解菌对糠醛的降解效果及影响因素的研究选取三株菌株中耐受性最强、降解效果最好的枯草芽孢杆菌DS3为研究对象,菌株DS3经过7天的生长和作用,17%-30%的糠醛能被降解。研究在液体培养条件下,不同环境因素对菌株DS3降解效果的影响。在单因素实验中,菌株DS3的最适降解pH为8,在第7天时,降解率能达到29.77%。菌株DS3对糠醛的降解效果最好,当pH过低或过高时,菌株DS3未表现出对糠醛的良好降解效果,降解率相应降低。菌株DS3的最适降解初始底物浓度为4000 mg L-1,降解率随底物浓度的增加而增大。菌株DS3的最适接种量为10%,接种量的增大使同时刻对糠醛的降解率有一定程度的增加。采用Box-Behnken方法对糠醛降解因素的响应面分析,相对于pH,底物浓度和接种量对降解率的影响更为显著。经过进一步分析计算,得到糠醛降解率达到预测最大值时的条件为：pH为8.73,糠醛初始浓度4000 mgL-1和接种量为10%,降解率达到37.2611%,此条件下响应预测值为99.1%。采用此条件优化后,菌株DS3对糠醛的降解率有小幅度提升,实测为36.91%。3.菌株DS3降解糠醛产物及代谢途径推测由傅里叶红外分析可以确定降解产物及底物中同时存在有醛或酮、亚甲基和伯醇。与未加菌种的糠醛溶液相比,DS3作用3d后的降解产物和7d后的降解产物中的基团种类基本相同,推测3-7天内,降解产物可能没有发生官能团上的转化而只是数量的累积。微生物对糠醛的降解可能都发生在醛基上,通过对醛基的转化来达到降低对微生物抑制的作用。经过进一步的GC-MS测试,菌株DS3降解糠醛的代谢产物中检测到糠醇,糠偶姻和3-羟基-2-丁酮。降解产物中无糠酸的存在,这与文献中报道的恶臭假单胞菌氧化糠醛代谢途径不一致。枯草芽孢杆菌DS3对糠醛的降解作用主要是通过醛基还原来完成。醇脱氢酶可能负责催化糠醛还原成糠醇的反应。推测3-羟基-2-丁酮是菌株DS3以糠醛为碳源底物分解代谢的产物。糠醛通过糖酵解途径生成丙酮酸,然后进入三羧酸循环分解,三羧酸循环过程中生成的NADH进入呼吸链,通过氧化磷酸化产生ATP；另一部分糠醛通过磷酸戊糖途径形成NADPH,并为脂肪酸和胆固醇等的合成提供重要的前体物。而过量的丙酮酸则通过乙酰CoA进入溢流代谢,生成3-羟基-2-丁酮。在此过程中分解出H20和C02。推断糠偶姻的产生是底物糠醛在细胞内的裂解酶的作用下发生偶姻缩合反应而得。微生物将糠醛分子中的醛基转化为其他基团能有效改善微生物所受到的毒害。菌株DS3将糠醛转化为低毒性物质,主要是转化为糠醇,以及糠偶姻和3-羟基-2-丁酮。从推测的降解底物的生物转化过程来看,糠醛参与了枯草芽孢杆菌DS3细胞内的多种代谢,与相关酶系的作用密不可分,与细胞体内的能量水平有着密切的关系。推测在此过程中发挥降解作用的酶系包括醇脱氢酶、a-乙酰乳酸脱羧酶、裂解酶、NADH等。由于代谢途径研究所得代谢产物较为微量,且由于时间和条件所限,没有结合核磁共振波谱、同位素示踪等技术方法以及与代谢产物的标准品对照等鉴定手段对其他可能的中间产物进行细致深入的研究,详细代谢途径尚待进一步完善补充。菌株DS3所产生的糠醛降解酶主要定位于细胞膜内,属于胞内酶。以HPLC测定酶对糠醛的降解率和全细胞SDS-PAGE电泳分析,确定降解酶为非诱导酶。无论底物中是否含有糠醛,降解酶均能被合成进而发挥降解作用。降解酶的合成只受微生物细胞内基因调控,不需环境中存在诱导物质即糠醛。糠醛降解酶相较于菌体本身,在发挥降解作用时,迅速而高效,在反应开始8h时,培养基中糠醛浓度由2000 mg L-1降为1379.79 mg L-1,即降解率为31.01%；而糠醇的生成保持在464.73 mg L-1左右。在降解酶的作用下,糠醇的生成主要在0-2h内发生,当反应超过2h之后,糠醇的量没有累积；糠醛对糠醇的转化可能已经结束,而对其他物质(比如糠偶姻和3-羟基-2-丁酮)的转化还在进行中,糠醛还在继续参与细胞内的代谢反应。糠醇为糠醛的主要生物降解产物。降解酶粗酶中不仅仅包含醇脱氢酶,还包括将糠醛转化为糠偶姻和3-羟基-2-丁酮等化合物的其他酶系,尤其是各种代谢反应的酶系,但醇脱氢酶在糠醛降解过程中发挥了主要作用。4.降解菌在皂素废水中的应用以皂素废水厂生产废水为处理对象,通过添加菌株DS3对其中高浓度的有机污染物进行降解。皂素生产采取硫酸水解原材料,废水中含有大量的硫酸根离子。经过实验证明,菌株DS3能耐受高浓度的硫酸根离子,在硫酸根离子浓度高达8000 mg L-1的废水中表现出良好的生长特性,菌株DS3在72小时之内对皂素废水中的COD的去除效率达到50.71%,具有良好的去除皂素废水中有机污染物的能力。菌株DS3同时具备耐受高浓度硫酸根离子和降解糠醛有机污染物的两大特性,具有较好的实用价值。
【学位单位】：中国地质大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：X787;X172
【部分图文】：

?２０１５．５??图２－３菌株ＤＳ３在扫描电镜下的形态恃征??Ｆｉｇ２－３?Ｓｃａｎｎｉｎｇ?ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?ｉｍａｇｅ?ｏｆ?ｓｔｒａｉｎ?ＤＳ３??ｍＳｍｍ??图２－４菌株ＤＳ４在扫描电镜下的形态恃征??Ｆｉｇ２－４?Ｓｃａｎｎｉｎｇ?ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ?ｉｍａｇｅ?ｏｆ?ｓｔｒａｉｎ?ＤＳ４??２．３．３菌株的穂酸耐受性??为了同时验证織酸能巧作为降解荫的唯一碳源，本研巧在测试菌种对慷膝耐受性时，??采用了仅含慷酸作为碳源的筛选培养基。降解菌株对慷酸的耐受程度在慷膝污染治理中有??着重要影响。本试验中，逐步提高培养基中慷醇的浓度，考察筛选出的优势菌种对慷藤的??耐受程度。参考己报道文献中菌株对穂酸的耐受性，设置本试验中慷薛浓度按梯度分布，??分别为?５００ｍｇＬ－ｌ，１０００ｍｇＬ－ｌ，２０００ｍｇＬ－ｌ，４０００ｍｇＬ－ｌ，６０００ｍｇＬ－ｌ，经过３ｄ的培养，??部分平板上有茵落生成，生长状况不尽相同。经过重复多次，得出耐受性结果如表２－２所??示。表中，菌落占平板表面积一半及Ｗ上，视为菌株生长良好，Ｗ＂＋＋＋＂标记：菌落不??到平板表面积一半，视为菌株生长一般，！＾?＂＋＋＂惊记；平板表面仅零星化个菌落存在，??视为菌株少量生长

２．３．４菌株的生长曲线??根据上述的耐受性实验可知，ＤＳ１、ＤＳ３、ＤＳ４Ｈ株菌株均可在錶醒浓度ｌＯＯＯｍｇＬ－ｉ??的环境中生长。从图２－５到２－７可Ｗ看出：浓度为１０００?ｍｇ?Ｌ－１的線酵对Ｈ株菌株的生长表??现出相同的抑制作用。ＤＳ１、ＤＳ３、ＤＳ４Ｈ株菌株在ＬＢ液体培养基中的菌浓度（ＯＤｅｏｔｈｕｎ）??要高于同期在添加了?ｌＯＯＯｍｇｌ／ｉ據酵的ＬＢ培养基中的浓度（ＯＤｓｏｏｎｍ）。当培养基中添加??了辕酵后，Ｓ株菌株的生长速率明显减慢，延滞期增加。在添加了?ｌＯＯＯｍｇＬ－１慷酸之后，??ＤＳ１的延滞期由大约化延长至８ｈ；?ＤＳ３的延滞期由大约４ｈ延长至如；ＤＳ４的延滞期由大??约４ｈ延长至１２ｈ。其中茵株ＤＳ３相对于其他２株菌株对穂醒的适应能力强。??３－０「?３－０「?，??。ｒｎｇＬ．，?—０?ｍｇＬ‘，??２５－?－？－１０００?ｍｇＬ＇??■?＊２５?－＊－，〇〇〇邮１??Ｉ?２－０?■?Ｊ???？?Ｉ?２．０?－??Ｉ－＇?／ｆ?！－■?／／??０．０?－?０．０?－?ｒ＊＾??ｔ?■?ｔ?■?１?■?ｔ?■?ｆ?．?Ｉ?．?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?Ｉ?＊?＼?Ｉ?Ｉ??０?５?１０?巧?２０?巧孤?３５?０?５?ｔｏ?巧?２０?２５?沉巧??＂ｍｅ?（ｈ》?ｔ

２．３．４菌株的生长曲线??根据上述的耐受性实验可知，ＤＳ１、ＤＳ３、ＤＳ４Ｈ株菌株均可在錶醒浓度ｌＯＯＯｍｇＬ－ｉ??的环境中生长。从图２－５到２－７可Ｗ看出：浓度为１０００?ｍｇ?Ｌ－１的線酵对Ｈ株菌株的生长表??现出相同的抑制作用。ＤＳ１、ＤＳ３、ＤＳ４Ｈ株菌株在ＬＢ液体培养基中的菌浓度（ＯＤｅｏｔｈｕｎ）??要高于同期在添加了?ｌＯＯＯｍｇｌ／ｉ據酵的ＬＢ培养基中的浓度（ＯＤｓｏｏｎｍ）。当培养基中添加??了辕酵后，Ｓ株菌株的生长速率明显减慢，延滞期增加。在添加了?ｌＯＯＯｍｇＬ－１慷酸之后，??ＤＳ１的延滞期由大约化延长至８ｈ；?ＤＳ３的延滞期由大约４ｈ延长至如；ＤＳ４的延滞期由大??约４ｈ延长至１２ｈ。其中茵株ＤＳ３相对于其他２株菌株对穂醒的适应能力强。??３－０「?３－０「?，??。ｒｎｇＬ．，?—０?ｍｇＬ‘，??２５－?－？－１０００?ｍｇＬ＇??■?＊２５?－＊－，〇〇〇邮１??Ｉ?２－０?■?Ｊ???？?Ｉ?２．０?－??Ｉ－＇?／ｆ?！－■?／／??０．０?－?０．０?－?ｒ＊＾??ｔ?■?ｔ?■?１?■?ｔ?■?ｆ?．?Ｉ?．?Ｉ?■?Ｉ?■?Ｉ?Ｉ?＊?＼?Ｉ?Ｉ??０?５?１０?巧?２０?巧孤?３５?０?５?ｔｏ?巧?２０?２５?沉巧??＂ｍｅ?（ｈ》?ｔ
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 杨国先;;酱香型白酒中糠醛的作用及测定方法研究[J];计量与测试技术;2009年09期

2 王惠丰,呼世斌;吸收-消化工艺处理薯蓣皂素废水的研究[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);2004年05期

相关博士学位论文 前1条

1 齐云;氯苯甲酸降解菌的分离筛选及降解特性研究[D];天津大学;2007年

本文编号：2889800