转录组学、蛋白质组学研究海州香薷Cu吸收与耐性分子机理及其cDNA文库的构建
发布时间：2021-03-17 11:34
海州香薷（Elsholtzia splendens）为唇形科香薷属一年生草本植物,对铜有较高的耐性和累积能力,被鉴定为铜耐性/富集植物。近年来,利用海州香薷进行Cu污染土壤的修复研究及海州香薷对铜吸收累积与耐性解毒的分子机理研究受到广大生物和环境科学学者的关注。本论文以海州香薷为材料,采用水培试验,运用cDNA-AFLP、实时荧光定量PCR、SDS-PAGE、2D-PAGE、MALDI-TOF MS和LTQ-ESI-MS/MS等技术,研究高铜和缺铜胁迫对海州香薷转录组和蛋白质组的影响,首次从转录组学和蛋白质组学的水平阐释了海州香薷对铜吸收累积与耐性解毒的分子机理。此外,还应用SMART技术构建了海州香薷高铜和缺铜胁迫的全长cDNA文库,为开展海州香薷功能基因组学研究提供了宝贵资源。主要研究结果如下:1、海州香薷高Cu、缺Cu胁迫的转录组学研究在转录组学研究中,采用cDNA-AFLP技术筛选海州香薷根尖（约3～5cm）基因在缺铜（0μmol/L CuSO4）和高铜（100βmol/L CuSO4）处理期间,四个时间点（0h、3h、6h和24h）...
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：187 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
目录
第一章 文献综述
1.1 植物对土壤重金属的吸收与累积机理
1.1.1 植物可吸收的重金属形态
1.1.2 植物对根际土壤重金属的活化
1.1.3 植物对重金属的吸收
1.1.4 重金属在植物体内的转运
1.1.5 重金属在植物体内的分配与贮存
1.1.6 重金属跨膜转运的吸收累积机制
1.2 植物对重金属的耐性与解毒机理
1.2.1 细胞壁与重金属结合
1.2.2 重金属的外排
1.2.3 重金属的区室化作用
1.2.4 对重金属的络合作用
1.2.5 重金属耐性相关蛋白
1.3 植物对Cu的吸收解毒机理研究进展
1.3.1 植物对Cu的吸收
1.3.2 铜在植物体内的转运
1.3.3 铜缺乏对植物的影响
1.3.4 铜过量对植物的毒害
1.3.5 铜污染土壤的植物修复
1.4 转录组学及其在环境科学中的研究进展
1.4.1 cDNA-AFLP技术原理与方法
1.4.2 cDNA-AFLP技术特点
1.4.3 cDNA-AFLP技术及其在环境科学中的应用
1.5 蛋白质组学及其在环境科学中的研究进展
1.5.1 蛋白质组学的概念
1.5.2 蛋白质组学的研究方法和技术手段
1.5.2.1 蛋白质组学的研究方法
1.5.2.2 蛋白质组学的技术手段
1.5.3 蛋白质组学在环境科学中的应用研究进展
1.5.3.1 环境蛋白质组学研究简要的发展过程
1.5.3.2 微生物的环境蛋白质组学研究
1.5.3.3 植物的环境蛋白质组学研究
1.5.3.4 水生物的环境蛋白质组学研究
1.5.3.5 无脊椎生物的环境蛋白质组学研究
1.5.4 展望
1.6 cDNA文库
1.6.1 cDNA文库的种类
1.6.2 SMART法构建全长cDNA文库
1.6.3 cDNA文库质量的评价
1.7 论文立题依据和研究内容
1.7.1 立题依据
1.7.2 研究内容
1.7.3 技术路线
1.7.4 创新点
第二章 海州香薷Cu调节基因的转录组学分析
引言
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 所用主要试剂和培养基
2.2 实验方法
2.2.1 海州香薷材料准备
2.2.1.1 海州香薷培养
2.2.1.2 海州香薷胁迫处理
2.2.1.3 取样
2.2.2 海州香薷总RNA的提取
2.2.3 总RNA检测
2.2.4 mRNA纯化
2.2.5 cDNA-AFLP
2.2.5.1 第一链cDNA合成
2.2.5.2 第二链cDNA合成:采用LD-PCR扩增法
2.5.5.3 用QIAquick PCR Purification Kit纯化双链cDNA
2.2.5.4 cDNA酶切
2.2.5.5 连接反应
2.2.5.6 预扩增
2.2.5.7 选择性扩增
2.2.5.8 测序胶电泳
2.2.5.9 测序胶银染
2.2.5.10 DNA-AFLP差异片段的克隆
2.2.6 序列比较及基因功能分析
2.2.7 cDNA-AFLP片段的Real Time-PCR验证
2.2.7.1 实时荧光定量PCR引物与荧光探针合成
2.2.7.2 Real Time-PCR模板准备
2.2.7.3 Real Time-PCR反应
2.2.7.4 Real Time-PCR结果处理
2.3 结果与分析
2.3.1 总RNA的分离和质量检测
2.3.2 cDNA-AFLP
2.3.2.1 ds-cDNA的合成
2.3.2.2 预扩增产物检测
2.3.2.3 选择性扩增产物检测
2.3.2.4 选择性扩增差异条带的回收克隆与测序鉴定
2.3.2.5 差异条带序列分析与比较
2.3.3 TDF的实时荧光定量PCR验证
2.3.4 Cu诱导基因的表达模式
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 海州香薷Cu调节蛋白的蛋白质组学分析
引言
3.1 海州香薷双向电泳技术的研究
3.1.1 材料与方法
3.1.1.1 植物材料准备
3.1.1.2 实验仪器及试剂
3.1.1.3 实验前的准备工作
3.1.1.4 蛋白质的提取方法
3.1.1.5 蛋白样品制备
3.1.1.6 Bradford法蛋白定量
3.1.1.7 总蛋白的纯化
3.1.1.8 固相pH梯度双向凝胶电泳（IPG-2D-PAGE）
3.1.1.9 银染（Yan et al.2000）
3.1.1.10 图像采集与分析
3.1.2 结果与分析
3.1.2.1 海州香薷蛋白提取方法筛选
3.1.2.2 IPG（Immobilized pH gradeient）胶条pH值的选择
3.1.3 讨论
3.1.4 小结
3.2 海州香薷高铜胁迫下的蛋白质组研究
3.2.1 材料与方法
3.2.1.1 植物材料准备
3.2.1.2 实验仪器、试剂及实验准备工作
3.2.1.3 海州香薷铜含量的测定方法
3.2.1.4 海州香薷蛋白提取纯化方法
3.2.1.5 SDS-PAGE电泳
3.2.1.6 考马斯亮兰染色
3.2.1.7 固相pH梯度双向凝胶电泳
3.2.1.8 银染
3.2.1.9 图像采集与分析
3.2.1.10 蛋白的胶内胰酶消化
3.2.1.11 质谱鉴定
3.2.1.12 数据库的搜索和蛋白质的鉴定
3.2.2 结果与分析
3.2.2.1 海州香薷对铜的吸收
3.2.2.2 海州香薷根、叶铜胁迫蛋白的SDS-PAGE分析
3.2.2.3 铜胁迫处理条件下海州香薷根、叶蛋白的2-DE分析
3.2.2.4 根系差异蛋白的基因本体论分析
3.2.3 讨论
3.2.4 小结
3.3 海州香薷缺铜胁迫下的蛋白质组研究
3.3.1 材料与方法
3.3.1.1 植物材料准备
3.3.1.2 其它方法见3.2。
3.3.2 结果与分析
3.3.2.1 海州香薷缺Cu处理时根叶的铜含量
3.3.2.2 海州香薷根、叶铜胁迫蛋白的SDS-PAGE分析
3.3.2.3 缺铜胁迫处理条件下海州香薷根、叶蛋白的2D-PAGE分析
3.3.2.4 根系差异蛋白的基因本体论分析
3.3.3 讨论
3.3.4 小结
3.4 总结
第四章 海州香薷缺Cu和高Cu胁迫根cDNA文库的构建
引言
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 所用主要试剂和培养基
4.2 实验方法
4.2.1 海州香薷材料准备
4.2.1.1 海州香薷培养
4.2.1.2 海州香薷胁迫处理
4.2.1.3 取样
4.2.2 海州香薷总RNA的提取
4.2.3 总RNA检测
4.2.4 mRNA纯化
4.2.5 cDNA文库构建
4.2.5.1 第一链cDNA合成
4.4.5.2 第二链cDNA合成
4.2.5.3 蛋白酶K消化
4.2.5.4 限制性内切酶Sfi Ⅰ消化双链cDNA
4.2.5.5 用CHROMA SPINTM-400对cDNA进行分级分离
4.2.5.6 cDNA与载体λTripIEx2的连接
4.2.5.7 连接产物的包装
4.2.6 cDNA文库质量鉴定
4.2.6.1 文库滴度测定
4.2.6.2 文库插入片段大小以及重组率
4.2.7 原始文库的扩增与保存
4.3 结果与分析
4.3.1 总RNA的分离和质量检测
4.3.2 cDNA文库构建及质量检测
4.3.2.1 ds-cDNA的合成
TM-400分级"> 4.3.2.2 链cDNA的CHROMA SPINTM-400分级
4.3.2.3 cDNA与载体λTripIEx2的连接效率及文库滴度测定
4.3.2.4 cDNA文库插入片段大小及重组率
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 主要研究结论与展望
5.1 主要研究结论
5.1.1 海州香薷对缺铜、高铜胁迫的转录组学研究
5.1.2 海州香薷对缺铜、高铜胁迫的蛋白质组学研究
5.1.2.1 海州香薷双向电泳技术的研究
5.1.2.2 海州香薷高铜胁迫下的蛋白质组学研究
5.1.2.3 海州香薷缺铜胁迫下的蛋白质组学研究
5.1.2.4 小结
5.1.3 海州香薷缺铜、高铜胁迫全长cDNA文库的构建
5.2 主要创新点
5.3 研究展望
参考文献
图目录
Index of figures
表目录
Index of tables
附攻读博士期间发表及撰写的文章
【参考文献】：
期刊论文
[1]SMART技术及其应用进展[J]. 刘卫辉,窦科峰. 中国生物工程杂志. 2008(06)
[2]植物硒代谢积累及相关酶的研究进展[J]. 杜玉潇,李亚男,陈大清. 热带亚热带植物学报. 2007(03)
[3]环境蛋白组学及污染物分子毒性检测技术[J]. 吴兵,张徐祥,顾继东,程树培. 生态毒理学报. 2007(01)
[4]植物重金属转运蛋白及其在植物修复中的应用[J]. 鲁家米,刘延盛,周晓阳. 中国生态农业学报. 2007(01)
[5]蛋白质组学在大肠癌研究中的应用[J]. 李春峰,刘明. 实用肿瘤学杂志. 2006(06)
[6]植物对铜的吸收运输及毒害机理研究进展[J]. 田生科,李廷轩,杨肖娥,卢玲丽,彭红云. 土壤通报. 2006(02)
[7]cDNA文库构建策略及其分析研究进展[J]. 晏慧君,黄兴奇,程在全. 云南农业大学学报. 2006(01)
[8]螯合剂EDDS和EDTA诱导海州香薷积累土壤重金属的比较研究[J]. 钱猛,沈振国,魏岚. 农业环境科学学报. 2006(01)
[9]土壤中重金属形态分析及其环境学意义[J]. 韩春梅,王林山,巩宗强,许华夏. 生态学杂志. 2005(12)
[10]mRNA差异显示技术克隆中国葡萄属野生种核糖体RNA基因[J]. 张今今,王跃进. 西北植物学报. 2005(11)
博士论文
[1]小麦条锈菌cDNA文库构建和表达序列标签（ESTs）分析[D]. 张永红.西北农林科技大学 2006
[2]超积累植物商陆的锰富集机理及其对污染水体的修复潜力[D]. 薛生国.浙江大学 2005
硕士论文
[1]印度芥菜抗氧化系统在抵御过量铜毒害中的作用[D]. 王松华.南京农业大学 2003
本文编号：3087067
【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：187 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
目录
第一章 文献综述
1.1 植物对土壤重金属的吸收与累积机理
1.1.1 植物可吸收的重金属形态
1.1.2 植物对根际土壤重金属的活化
1.1.3 植物对重金属的吸收
1.1.4 重金属在植物体内的转运
1.1.5 重金属在植物体内的分配与贮存
1.1.6 重金属跨膜转运的吸收累积机制
1.2 植物对重金属的耐性与解毒机理
1.2.1 细胞壁与重金属结合
1.2.2 重金属的外排
1.2.3 重金属的区室化作用
1.2.4 对重金属的络合作用
1.2.5 重金属耐性相关蛋白
1.3 植物对Cu的吸收解毒机理研究进展
1.3.1 植物对Cu的吸收
1.3.2 铜在植物体内的转运
1.3.3 铜缺乏对植物的影响
1.3.4 铜过量对植物的毒害
1.3.5 铜污染土壤的植物修复
1.4 转录组学及其在环境科学中的研究进展
1.4.1 cDNA-AFLP技术原理与方法
1.4.2 cDNA-AFLP技术特点
1.4.3 cDNA-AFLP技术及其在环境科学中的应用
1.5 蛋白质组学及其在环境科学中的研究进展
1.5.1 蛋白质组学的概念
1.5.2 蛋白质组学的研究方法和技术手段
1.5.2.1 蛋白质组学的研究方法
1.5.2.2 蛋白质组学的技术手段
1.5.3 蛋白质组学在环境科学中的应用研究进展
1.5.3.1 环境蛋白质组学研究简要的发展过程
1.5.3.2 微生物的环境蛋白质组学研究
1.5.3.3 植物的环境蛋白质组学研究
1.5.3.4 水生物的环境蛋白质组学研究
1.5.3.5 无脊椎生物的环境蛋白质组学研究
1.5.4 展望
1.6 cDNA文库
1.6.1 cDNA文库的种类
1.6.2 SMART法构建全长cDNA文库
1.6.3 cDNA文库质量的评价
1.7 论文立题依据和研究内容
1.7.1 立题依据
1.7.2 研究内容
1.7.3 技术路线
1.7.4 创新点
第二章 海州香薷Cu调节基因的转录组学分析
引言
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 所用主要试剂和培养基
2.2 实验方法
2.2.1 海州香薷材料准备
2.2.1.1 海州香薷培养
2.2.1.2 海州香薷胁迫处理
2.2.1.3 取样
2.2.2 海州香薷总RNA的提取
2.2.3 总RNA检测
2.2.4 mRNA纯化
2.2.5 cDNA-AFLP
2.2.5.1 第一链cDNA合成
2.2.5.2 第二链cDNA合成:采用LD-PCR扩增法
2.5.5.3 用QIAquick PCR Purification Kit纯化双链cDNA
2.2.5.4 cDNA酶切
2.2.5.5 连接反应
2.2.5.6 预扩增
2.2.5.7 选择性扩增
2.2.5.8 测序胶电泳
2.2.5.9 测序胶银染
2.2.5.10 DNA-AFLP差异片段的克隆
2.2.6 序列比较及基因功能分析
2.2.7 cDNA-AFLP片段的Real Time-PCR验证
2.2.7.1 实时荧光定量PCR引物与荧光探针合成
2.2.7.2 Real Time-PCR模板准备
2.2.7.3 Real Time-PCR反应
2.2.7.4 Real Time-PCR结果处理
2.3 结果与分析
2.3.1 总RNA的分离和质量检测
2.3.2 cDNA-AFLP
2.3.2.1 ds-cDNA的合成
2.3.2.2 预扩增产物检测
2.3.2.3 选择性扩增产物检测
2.3.2.4 选择性扩增差异条带的回收克隆与测序鉴定
2.3.2.5 差异条带序列分析与比较
2.3.3 TDF的实时荧光定量PCR验证
2.3.4 Cu诱导基因的表达模式
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 海州香薷Cu调节蛋白的蛋白质组学分析
引言
3.1 海州香薷双向电泳技术的研究
3.1.1 材料与方法
3.1.1.1 植物材料准备
3.1.1.2 实验仪器及试剂
3.1.1.3 实验前的准备工作
3.1.1.4 蛋白质的提取方法
3.1.1.5 蛋白样品制备
3.1.1.6 Bradford法蛋白定量
3.1.1.7 总蛋白的纯化
3.1.1.8 固相pH梯度双向凝胶电泳（IPG-2D-PAGE）
3.1.1.9 银染（Yan et al.2000）
3.1.1.10 图像采集与分析
3.1.2 结果与分析
3.1.2.1 海州香薷蛋白提取方法筛选
3.1.2.2 IPG（Immobilized pH gradeient）胶条pH值的选择
3.1.3 讨论
3.1.4 小结
3.2 海州香薷高铜胁迫下的蛋白质组研究
3.2.1 材料与方法
3.2.1.1 植物材料准备
3.2.1.2 实验仪器、试剂及实验准备工作
3.2.1.3 海州香薷铜含量的测定方法
3.2.1.4 海州香薷蛋白提取纯化方法
3.2.1.5 SDS-PAGE电泳
3.2.1.6 考马斯亮兰染色
3.2.1.7 固相pH梯度双向凝胶电泳
3.2.1.8 银染
3.2.1.9 图像采集与分析
3.2.1.10 蛋白的胶内胰酶消化
3.2.1.11 质谱鉴定
3.2.1.12 数据库的搜索和蛋白质的鉴定
3.2.2 结果与分析
3.2.2.1 海州香薷对铜的吸收
3.2.2.2 海州香薷根、叶铜胁迫蛋白的SDS-PAGE分析
3.2.2.3 铜胁迫处理条件下海州香薷根、叶蛋白的2-DE分析
3.2.2.4 根系差异蛋白的基因本体论分析
3.2.3 讨论
3.2.4 小结
3.3 海州香薷缺铜胁迫下的蛋白质组研究
3.3.1 材料与方法
3.3.1.1 植物材料准备
3.3.1.2 其它方法见3.2。
3.3.2 结果与分析
3.3.2.1 海州香薷缺Cu处理时根叶的铜含量
3.3.2.2 海州香薷根、叶铜胁迫蛋白的SDS-PAGE分析
3.3.2.3 缺铜胁迫处理条件下海州香薷根、叶蛋白的2D-PAGE分析
3.3.2.4 根系差异蛋白的基因本体论分析
3.3.3 讨论
3.3.4 小结
3.4 总结
第四章 海州香薷缺Cu和高Cu胁迫根cDNA文库的构建
引言
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 所用主要试剂和培养基
4.2 实验方法
4.2.1 海州香薷材料准备
4.2.1.1 海州香薷培养
4.2.1.2 海州香薷胁迫处理
4.2.1.3 取样
4.2.2 海州香薷总RNA的提取
4.2.3 总RNA检测
4.2.4 mRNA纯化
4.2.5 cDNA文库构建
4.2.5.1 第一链cDNA合成
4.4.5.2 第二链cDNA合成
4.2.5.3 蛋白酶K消化
4.2.5.4 限制性内切酶Sfi Ⅰ消化双链cDNA
4.2.5.5 用CHROMA SPINTM-400对cDNA进行分级分离
4.2.5.6 cDNA与载体λTripIEx2的连接
4.2.5.7 连接产物的包装
4.2.6 cDNA文库质量鉴定
4.2.6.1 文库滴度测定
4.2.6.2 文库插入片段大小以及重组率
4.2.7 原始文库的扩增与保存
4.3 结果与分析
4.3.1 总RNA的分离和质量检测
4.3.2 cDNA文库构建及质量检测
4.3.2.1 ds-cDNA的合成
TM-400分级"> 4.3.2.2 链cDNA的CHROMA SPINTM-400分级
4.3.2.3 cDNA与载体λTripIEx2的连接效率及文库滴度测定
4.3.2.4 cDNA文库插入片段大小及重组率
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 主要研究结论与展望
5.1 主要研究结论
5.1.1 海州香薷对缺铜、高铜胁迫的转录组学研究
5.1.2 海州香薷对缺铜、高铜胁迫的蛋白质组学研究
5.1.2.1 海州香薷双向电泳技术的研究
5.1.2.2 海州香薷高铜胁迫下的蛋白质组学研究
5.1.2.3 海州香薷缺铜胁迫下的蛋白质组学研究
5.1.2.4 小结
5.1.3 海州香薷缺铜、高铜胁迫全长cDNA文库的构建
5.2 主要创新点
5.3 研究展望
参考文献
图目录
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表目录
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附攻读博士期间发表及撰写的文章
【参考文献】：
期刊论文
[1]SMART技术及其应用进展[J]. 刘卫辉,窦科峰. 中国生物工程杂志. 2008(06)
[2]植物硒代谢积累及相关酶的研究进展[J]. 杜玉潇,李亚男,陈大清. 热带亚热带植物学报. 2007(03)
[3]环境蛋白组学及污染物分子毒性检测技术[J]. 吴兵,张徐祥,顾继东,程树培. 生态毒理学报. 2007(01)
[4]植物重金属转运蛋白及其在植物修复中的应用[J]. 鲁家米,刘延盛,周晓阳. 中国生态农业学报. 2007(01)
[5]蛋白质组学在大肠癌研究中的应用[J]. 李春峰,刘明. 实用肿瘤学杂志. 2006(06)
[6]植物对铜的吸收运输及毒害机理研究进展[J]. 田生科,李廷轩,杨肖娥,卢玲丽,彭红云. 土壤通报. 2006(02)
[7]cDNA文库构建策略及其分析研究进展[J]. 晏慧君,黄兴奇,程在全. 云南农业大学学报. 2006(01)
[8]螯合剂EDDS和EDTA诱导海州香薷积累土壤重金属的比较研究[J]. 钱猛,沈振国,魏岚. 农业环境科学学报. 2006(01)
[9]土壤中重金属形态分析及其环境学意义[J]. 韩春梅,王林山,巩宗强,许华夏. 生态学杂志. 2005(12)
[10]mRNA差异显示技术克隆中国葡萄属野生种核糖体RNA基因[J]. 张今今,王跃进. 西北植物学报. 2005(11)
博士论文
[1]小麦条锈菌cDNA文库构建和表达序列标签（ESTs）分析[D]. 张永红.西北农林科技大学 2006
[2]超积累植物商陆的锰富集机理及其对污染水体的修复潜力[D]. 薛生国.浙江大学 2005
硕士论文
[1]印度芥菜抗氧化系统在抵御过量铜毒害中的作用[D]. 王松华.南京农业大学 2003
本文编号：3087067
本文链接：https://www.wllwen.com/shengtaihuanjingbaohulunwen/3087067.html
