水稻镉胁迫应答相关microRNA的分离与功能研究

发布时间：2021-06-27 09:26

　　镉（Cadmium, Cd）是主要的重金属污染元素,水稻（Oryza sativa）是重要的粮食作物。Cd严重影响水稻的生长和产量,并危害人体健康。microRNA （miRNA）是一类新型的调控基因表达的小分子RNA,它对植物生长发育以及多种逆境胁迫响应的调节发挥着重要作用。研究miRNA在水稻重金属Cd胁迫应答过程中的功能,将有助于加强对基因表达调控机制和植物重金属耐性分子机理的理解,也可为通过小分子RNA的遗传操作改良作物的抗逆性提供新思路。本研究以粳稻中花11为材料,利用miRNA微阵列芯片和荧光定量PCR技术筛选、验证得到了19个与Cd胁迫应答相关的miRNA。miR528在Cd胁迫下表达显著上调,miRl66、miR171、miRl68、miR162、miR396、miR390、miR156、miR1432和miR444b.1等的表达则受到显著抑制。对Cd胁迫下差异表达的miRNA的靶基因进行生物信息学预测,发现这些靶基因多为调节性基因,包括调控下游基因表达的转录因子,参与信号转导的蛋白激酶和钙调素结合蛋白等。它们参与调控植物的生长发育、信号转导以及多种胁迫反应。并从中选取... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：116 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 文献综述
    1 植物miRNA
        1.1 植物miRNA的生物合成
        1.2 植物体内miRNA的鉴定及表达分析
            1.2.1 克隆与高通量测序
            1.2.2 生物信息学预测
            1.2.3 遗传学筛选
            1.2.4 miRNA表达量分析
        1.3 植物miRNA靶基因的识别和鉴定
        1.4 植物体内miRNA的功能
            1.4.1 miRNA参与植物生长发育调控
            1.4.2 miRNA参与激素调节与信号转导
            1.4.3 miRNA参与植物逆境胁迫应答
                1.4.3.1 抗环境胁迫
                1.4.3.2 抗营养胁迫
                1.4.3.3 抗生物胁迫
    2 Cd毒害与植物
        2.1 Cd对植物的毒害作用
            2.1.1 Cd影响植物生长
            2.1.2 Cd影响水分吸收和营养平衡
            2.1.3 Cd影响呼吸作用
            2.1.4 Cd影响光合作用
            2.1.5 Cd导致氧化胁迫
        2.2 植物对Cd的耐受作用
            2.2.1 限制Cd进入植物体内
            2.2.2 Cd的螯合和区室化
            2.2.3 激活植物体内抗氧化防御系统
            2.2.4 诱导胁迫蛋白
    3 miRNA在重金属胁迫应答中的作用
        3.1 miR398与重金属胁迫
        3.2 非必需重金属胁迫相关的miRNA
    4 研究目的和意义
第二章 Cd胁迫相关miRNA的分离与鉴定
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试验方法
            1.2.1 水稻幼苗的培养
            1.2.2 Cd胁迫处理
            1.2.3 水稻根总RNA的提取
            1.2.4 miRNA芯片实验
            1.2.5 实时定量PCR检测miRNA表达
            1.2.6 半定量RT-PCR检测miRNA前体的表达
            1.2.7 miRNA基因上游启动子的确定以及顺式作用元件分析
    2 结果与分析
        2.1 miRNA芯片分离获得19个Cd胁迫相关的miRNA
        2.2 荧光定量PCR和半定量RT-PCR验证miRNA芯片结果
        2.3 miRNA基因上游胁迫相关顺式作用元件预测与重金属响应元件分析
    3 小结与讨论
        3.1 miRNA微阵列芯片鉴定Cd胁迫相关miRNA的优缺点
        3.2 Cd胁迫相关miRNA种类
        3.3 Cd胁迫相关miRNA的顺式作用元件分析与讨论
第三章 Cd胁迫相关miRNA靶基因的预测与表达分析
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试验方法
            1.2.1 生物信息学方法预测miRNA的靶基因
            1.2.2 实时定量PCR检测miRNA靶基因的表达
    2 结果与分析
        2.1 Cd胁迫相关miRNA的靶基因预测分析
            2.1.1 转录因子
            2.1.2 蛋白激酶
            2.1.3 钙信号分子
            2.1.4 miRNA生物加工或作用中的重要蛋白
        2.2 Cd胁迫相关miRNA的靶基因的表达水平检测
    3 讨论
        3.1 miRNA同时参与植物的生长发育和胁迫应答的调控
        3.2 miRNA调控靶基因的复杂性
    4 本章小结
第四章 过表达miR166对水稻Cd胁迫耐受性的影响研究
    1 材料与方法
        1.1 试验材料
        1.2 试验试剂
        1.3 miRNA过表达载体(35S：MIRNA)的构建
            1.3.1 克隆引物设计
            1.3.2 载体构建流程
        1.4 农杆菌转化及农杆菌介导的水稻转基因
            1.4.1 农杆菌感受态的制备与转化
            1.4.2 农杆菌介导的水稻转基因
        1.5 转基因阳性植株的鉴定
            1.5.1 叶片潮霉素筛选
            1.5.2 GUS蛋白的组织化学染色
            1.5.3 荧光定量PCR鉴定miRNA及其靶基因的表达
        1.6 转基因水稻对Cd胁迫的响应
            1.6.1 Hyg抗性遗传分析
            1.6.2 转基因水稻植株Cd处理表型观察
                1.6.2.1 叶绿素含量测定
                1.6.2.2 丙二醛含量测定
                1.6.2.3 H_2O_2含量测定
                1.6.2.4 Cd含量测定
                1.6.2.5 数据分析
            1.6.3 转基因水稻种子在Cd处理下的萌发情况
            1.6.4 转基因水稻干旱处理
    2 结果与分析
        2.1 过表达载体35S：MIR166m的构建及在水稻中的遗传转化
        2.2 35S：MIRNA转基因植株的鉴定
            2.2.1 转基因水稻的Hyg检测和GUS组织化学活性分析
            2.2.2 转基因水稻中miRNA及其靶基因的表达检测
        2.3
            2.3.2 过表达miR166提高水稻苗期对Cd胁迫的耐受性
            2.3.3 过表达miR166提高水稻对干旱胁迫的耐受性
    3 小结与讨论
        3.1 35S：MIRNA过表达载体的构建
        3.2 miR166过表达导致水稻对Cd的耐受性增强
第五章 结论与展望
    1 全文结论
    2 创新之处
    3 研究展望
参考文献
作者简历及攻读博士学位期间取得的科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]高表达拟南芥miR396提高烟草抗旱性（英文）[J]. 杨凤玺,余迪求.  云南植物研究. 2009(05)
[2]内源小RNAs在植物胁迫反应中的作用[J]. 谢兆辉.  遗传. 2009(08)
[3]一种检测microRNA表达的微阵列芯片的研制及应用[J]. 骆明勇,田志刚,徐智,张亮,王应雄,程京.  生物化学与生物物理进展. 2007(01)
[4]植物金属硫蛋白及其重金属解毒机制研究进展[J]. 全先庆,张洪涛,单雷,毕玉平.  遗传. 2006(03)
[5]植物对重金属镉的耐受机制[J]. 张军,束文圣.  植物生理与分子生物学学报. 2006(01)
[6]植物富含亮氨酸重复序列型类受体蛋白激酶的生物学功能[J]. 马媛媛,甘睿,王宁宁.  植物生理与分子生物学学报. 2005(04)

博士论文
[1]一氧化氮缓解水稻镉毒害的作用及其生理机制[D]. 熊杰.浙江大学 2009
[2]镉诱导植物氧化代谢与钙信使的变化及分子机理[D]. 赵士诚.中国农业科学院 2008
[3]水稻镉耐性和积累的基因型差异与机理研究[D]. 邵国胜.浙江大学 2005



本文编号：3252585