假单胞菌降解尼古丁的分子机制研究

发布时间：2021-08-27 01:02

　　尼古丁是一种天然的生物碱,进入人体后能对多种组织如心、脑、肺和血管等造成损伤,容易引发肺癌在内的多种疾病。我国是烟草生产和消费的大国,烟草加工过程中所产生的废弃物中含有较高浓度的尼古丁,给环境带来极大威胁。微生物处理该类型的污染是一种高效、可靠和无二次污染的绿色处理方式。因此,筛选高效降解尼古丁的微生物菌种资源,探索其降解机制机理,充分发挥其降解能力,具有重要的理论意义和应用价值。本研究的意义在于分离、筛选高效尼古丁降解菌株,并对菌株在不同环境条件下降解尼古丁的特性进行研究,测定降解途径,克隆关键降解酶基因,从生物化学和分子生物学角度揭示Pseudomonas sp. HZN6降解尼古丁的新机制,为尼古丁引起的环境污染的微生物降解修复及绿色转化提供理论和技术依据。本研究从从杭州农药厂的活性污泥中分离到1株尼古丁高效降解菌株HNZ6,可以利用尼古丁为唯一碳源、氮源和能源生长。根据生理生化特征以及16S rRNA （GenBank登录号为HQ108345）系统发育分析,确定菌株HZN6为假单胞菌属（Pseudomonas）细菌。研究了不同条件对HZN6降解尼古丁的影响,结果显示降解尼古丁的... 

【文章来源】：浙江大学浙江省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：180 页

【学位级别】：博士

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目录
摘要
ABSTRACT
1 绪论
    1.1 尼古丁及其理化性质
    1.2 尼古丁对环境的污染及生物毒性
        1.2.1 不同来源的尼古丁对环境的污染
        1.2.2 尼古丁的生物毒性
    1.3 微生物降解尼古丁的机制研究进展
        1.3.1 降解尼古丁的微生物种类
        1.3.2 尼古丁的微生物代谢途径及分子机制
    1.4 微生物降解尼古丁的应用研究
    1.5 本研究的目的、意义和主要内容
        1.5.1 研究的目的和意义
        1.5.2 研究的主要内容
2 尼古丁降解菌Pseudomonas sp.HZN6的分离、鉴定、降解特性及降解途径的研究
    2.1 引言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 菌株、试剂与培养基
        2.2.2 降解菌株的富集与分离
        2.2.3 降解菌株的培养特征及生理生化鉴定
        2.2.4 菌体基因组DNA的提取
        2.2.5 菌株16S rRNA基因的PCR扩增
        2.2.6 16S rRNA基因PCR产物的T/A克隆
        2.2.7 大肠杆菌感受态细胞的制备与酶连产物的转化
        2.2.8 质粒DNA的小量提取
        2.2.9 16S rRNA基因序列测定和系统发育地位的确定
        2.2.10 菌体生长量的测定及降解种子液的制备
        2.2.11 尼古丁及中间产物检测方法
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 尼古丁降解菌株的分离与筛选
        2.3.2 降解菌株的菌落形态及生理生化特征
        2.3.3 降解菌株的系统发育地位研究
        2.3.4 环境条件对菌株HZN6降解尼古丁的影响
        2.3.5 尼古丁的代谢产物鉴定和代谢途径分析
    2.4 小结
3 转座子随机突变文库构建与筛选
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 菌株和质粒
        3.2.2 试剂与培养基
        3.2.3 菌株的培养条件
        3.2.4 转座子诱变
        3.2.5 尼古丁降解失活突变株的筛选
        3.2.6 尼古丁降解失活突变株的验证
        3.2.7 尼古丁及其中间产物的检测方法
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 转座子诱变最优条件的选择
        3.3.2 转座突变的效率
        3.3.3 几株代表性突变株的表型分析
    3.4 小结
4 3-琥珀酰吡啶降解相关基因sirA2的克隆和功能鉴定
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 试剂与培养基
        4.2.2 菌株、质粒与培养条件
        4.2.3 分子生物学操作方法
        4.2.4 转座子插入突变基因的SEFA-PCR克隆
        4.2.5 克隆序列的测定、组装与分析
        4.2.6 sirA2基因的敲除
        4.2.7 sirA2基因的功能互补
        4.2.8 重组菌株降解尼古丁、SP和次黄嘌呤的特性分析
        4.2.9 尼古丁、SP和次黄嘌呤的检测方法
    4.3 结果与分析
        4.3.1 突变株N6ml的筛选与表型分析
        4.3.2 SEFA-PCR克隆突变基因
        4.3.3 克隆基因的测序、组装与分析
        4.3.4 sirA2基因的敲除与功能互补
        4.3.5 钨对SP和次黄嘌呤降解的影响
    4.4 讨论
        4.4.1 sirA基因的来源与功能
        4.4.2 硫转移酶与羟化酶的相互关系
    4.5 小结
5 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶的克隆、表达和酶学特性研究
    5.1 引言
    5.2 材料与方法
        5.2.1 试剂与培养基
        5.2.2 菌株、质粒与培养条件
        5.2.3 分子生物学操作方法
        5.2.4 突变株N6mC8突变基因的SEFA-PCR克隆
        5.2.5 克隆序列的测定、组装与分析
        5.2.6 假氧尼古丁氧化酶和3-琥珀酰半醛吡啶脱氢酶的异源表达和纯化
        5.2.7 尼古丁及代谢产物的检测方法
        5.2.8 酶的功能鉴定、动力学参数测定及酶学特性分析
        5.2.9 pao和sap基因的敲除
        5.2.10 pao基因的功能互补
        5.2.11 重组菌株降解特性分析
    5.3 结果与分析
        5.3.1 突变株N6mC8的筛选与表型分析
        5.3.2 SEFA-PCR克隆突变基因
        5.3.3 克隆基因的测序、组装与分析
        5.3.4 PNAO和SAPD的基因克隆、异源表达与纯化
        5.3.5 PNAO的辅酶FAD
        5.3.6 PNAO的功能鉴定
        5.3.7 PNAO的酶学特性与动力学参数
        5.3.8 SAPD的功能鉴定
        5.3.9 pao和sap基因的敲除与功能互补
        5.3.10 重组菌株的降解特性分析
    5.4 讨论
        5.4.1 pao和sap基因为新基因
        5.4.2 PNAO酶的特性
    5.5 小结
6 尼古丁氧化酶基因的克隆和功能鉴定
    6.1 引言
    6.2 材料与方法
        6.2.1 试剂与培养基
        6.2.2 菌株、质粒与培养条件
        6.2.3 常规分子生物学操作方法
        6.2.4 pao基因上游基因序列的SEFA-PCR克隆
        6.2.5 克隆序列的测定、组装与分析
        6.2.6 尼古丁氧化酶NOX的基因克隆、异源表达与纯化
        6.2.7 nox基因的敲除
        6.2.8 nox基因的功能互补
        6.2.9 RNA的提取与RT-PCR
        6.2.10 NOX蛋白三维结构的预测与分子对接
        6.2.11 NOX蛋白的定点突变
        6.2.12 重组菌株降解特性分析
        6.2.13 尼古丁及中间产物的分析方法
    6.3 结果与分析
        6.3.1 SEFA-PCR克隆pao基因上游未知序列
        6.3.2 克隆基因的测序、组装与分析
        6.3.3 nox基因的体外功能鉴定
        6.3.4 nox基因的转录
        6.3.5 nox基因的体内敲除与功能互补
        6.3.6 重组菌株的降解特性
        6.3.7 NOX的无手性选择性降解尼古丁
        6.3.8 NOX的异源表达与纯化
        6.3.9 NOX的同源模建与分子对接
        6.3.10 NOX的定点突变
    6.4 讨论
    6.5 小结
7 论文总结
    7.1 研究结论
    7.2 创新点
    7.3 不足与展望
参考文献
攻读博士学位期间研究成果与个人荣誉
    研究成果
    个人荣誉
致谢



本文编号：3365327