理性设计提高嗜热酯酶对有机磷化合物的敏感性

发布时间：2021-10-10 09:23

　　利用酯酶作为有机磷农药的生物检测剂,在环保和食品安全等方面有着重要的作用,其检测方便,灵敏度高等特点为其广泛应用于有机磷化合物（OPs）残留物的检测,提供了重要的依据。用乙酰胆碱酯酶（AChE）检测有机磷农药,己不单单只停留在实验阶段,市场上已有许多利用AChE而开发的农药检测试剂盒,但哺乳动物来源的AChE稳定性较差,限制了其应用,所以开发新型的生物检测剂成为了生物工程领域和工业应用领域的研究热点。本文以具有高度热稳定性的嗜热酯酶作为研究对象,对其与OPs反应的抑制反应机理等进行了系统的研究。我们以来源于嗜热菌Archaeoglobus fulgidus的嗜热酯酶AFEST作为研究对象,测定了其与7种结构不同的OPs的抑制反应。通过与农药检测试剂盒中的AChE的比较,证实了AFEST对有机磷化合物具有一定的敏感度,但广谱性较低。随后我们通过对AFEST结构的分析,选择突变位点,成功的构建了双点突变体N44S/S48V。突变体N44S/S48V对7种OPs的敏感度均有所提高,而且对其中4种的敏感度已经超越了AChE。突变体拓宽了AFEST能敏感反应的OPs的种类,为AFEST能成功取代... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：112 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1.1 有机磷化合物简介
        1.1.1 有机磷化合物的种类
        1.1.2 农药检测技术
    1.2 生物感受器
        1.2.1 乙酰胆碱酯酶
        1.2.2 其他生物感受器
    1.3 酶与抑制剂相互作用的研究方法
        1.3.1 抑制类型的简介
        1.3.2 抑制动力学
        1.3.3 半抑制浓度(IC_(50))
    1.4 固定化
    1.5 嗜热羧酸酯酶简介
    1.6 立题依据
    1.7 参考文献
第二章 嗜热酯酶AFEST与有机磷化合物反应的研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 菌种
        2.2.2 试剂
        2.2.3 实验仪器
        2.2.4 溶液配制
    2.3 实验方法
        2.3.1 嗜热酯酶AFEST的制备
        2.3.2 嗜热酯酶AFEST的镍亲和柱纯化
        2.3.3 酯酶活力的测定
        2.3.4 动力学常数测定
        2.3.5 抑制反应时间的确定
        2.3.6 抑制动力学的研究
        2.3.7 半抑制浓度的测定
        2.3.8 稳定性研究
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 嗜热酯酶AFEST的制备
        2.4.2 孵育时间的确定
        2.4.3 抑制动力学的研究
        2.4.4 半抑制浓度的研究
        2.4.5 稳定性研究
    2.5 小结
    2.6 参考文献
第三章 嗜热酯酶AFEST的半理性设计
    3.1 引言
    3.2 实验材料与方法
        3.2.1 实验材料
        3.2.2 同源序列比对,蛋白质三级结构比对及蛋白质底物口袋大小的测定
        3.2.3 突变体的构建
        3.2.4 突变体的纯化
        3.2.5 突变体活力的测定
        3.2.6 突变体动力学常数的测定
        3.2.7 突变体IC_(50)的测定
        3.2.8 双点突变体N44S/S48V抑制动力学的测定
        3.2.9 突变体稳定性的测定
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 突变位点的确定
        3.3.2 突变体的筛选
        3.3.3 新突变位点的确定
        3.3.4 突变体纯化及动力学结果
        3.3.5 IC_(50)数据分析
        3.3.6 抑制动力学的研究
        3.3.7 突变体稳定性的研究
        3.3.8 突变体模型的建立
        3.3.9 对接模型的研究
    3.4 小结
    3.5 参考文献
第四章 酶固定化
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 试剂
        4.2.2 仪器
        4.2.3 溶液配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 固定化条件的摸索
        4.3.2 固定化酶活力的测定
        4.3.3 固定化酶稳定性的测定
        4.3.4 固定化酶对有机磷农药的检测
    4.4 实验结果及讨论
        4.4.1 固定化条件的确定
        4.4.2 固定化酶活力及固定化效率的测定
        4.4.3 固定化酶对有机磷化合物的检测
        4.4.4 固定化酶稳定性的研究
    4.5 小结
    4.6 参考文献
创新点
展望
作者简历
参与的科研课题
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]戊二醛交联壳聚糖固定化青霉素G酰化酶及其性质研究[J]. 程仕伟,贾彦荣,缪静,屈慧鸽.  烟台大学学报(自然科学与工程版). 2011(02)
[2]有机磷及氨基甲酸酯类农药残留检测研究进展[J]. 万圣,吕延成.  广东农业科学. 2009(03)
[3]大分子拥挤下介孔中木瓜蛋白酶的微波辅助固定化[J]. 刘明庆,王安明,王华,周成,杜志强,祝社民,杨明,张俊,沈树宝.  过程工程学报. 2009(01)
[4]缓冲QuEChERS法提取气相色谱火焰光度检测法快速测定水果蔬菜中39种有机磷农药残留[J]. 张秀尧,蔡欣欣,陈珞洛,郑三燕.  中国卫生检验杂志. 2007(12)
[5]气相色谱-质谱法测定茶叶中42种残留农药[J]. 董金斌,王金花,卢晓宇,徐超一,杨俊佼.  北京化工大学学报(自然科学版). 2007(05)
[6]毛细管气相色谱法测定蔬菜中残留硫线磷[J]. 应兴华,徐霞,陈能,朱智伟.  理化检验(化学分册). 2006(03)
[7]固定化对动植物酯酶性质的影响[J]. 许学勤,徐斐,吴燕雯,吴瑛,华泽钊.  食品与发酵工业. 2004(07)
[8]食品中农药残留快速检测方法的研究[J]. 刘慧,闫树刚,朱力.  中国农学通报. 2003(04)
[9]固定化酶的制备及应用[J]. 李彦锋,李军荣,伏莲娣.  高分子通报. 2001(02)
[10]酶的固定化技术及其应用[J]. 张伟,杨秀山.  自然杂志. 2000(05)



本文编号：3428102