细菌分解代谢氮杂环污染物尼古丁的分子机制研究
发布时间：2022-09-17 19:44
尼古丁是N-杂环污染物的典型代表,1994年就被列入了美国环保局的有毒物质释放清单,致瘾性和毒性很强,容易诱发多种疾病。尼古丁污染主要来自于烟草工业中产生的富含尼古丁的烟草废弃物和人们随意丢弃的富含尼古丁的烟蒂垃圾。我国的烟草生产量和消费量世界最大,每年产生的尼古丁污染物以百万吨计,极大地威胁着自然环境和人类健康。因此,消除尼古丁的污染迫在眉睫。微生物修复以其快速、高效、无二次污染的特点而受到大家的广泛关注。目前已报道的尼古丁代谢微生物主要集中在节杆菌属（Arthrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）细菌中。除尼古丁降解能力外,这些细菌还具有很强的环境适应能力,揭示它们的尼古丁代谢途径和分子机制,探索其中关键酶的酶学和结构特性,阐释它们环境存活能力的基因基础,能够指导对这些细菌的定向改造,具有极大的理论研究价值和应用前景。根据其他推测或已报道的2,5-二羟基吡啶（2,5-DHP）代谢途径,本研究首次提出并验证了假单胞菌中尼古丁吡咯烷下游代谢途径如下:尼古丁降解生成的2,5-DHP开环裂解生成N-甲酰基马来酰胺酸（NFM）,然后NFM去甲酰生成马来酰胺酸和甲酸,马来酰胺...
【文章页数】：222 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略表
第一章 前言
1.1 氮杂环污染物概述
1.2 尼古丁及其环境污染
1.2.1 尼古丁的基本性质
1.2.2 尼古丁的毒害作用
1.2.3 环境中的尼古丁污染
1.3 微生物尼古丁代谢机制研究进展
1.3.1 尼古丁代谢微生物
1.3.2 微生物代谢尼古丁的途径及分子机制
1.3.2.1 脱甲基代谢途径
1.3.2.2 吡啶代谢途径及分子机制
1.3.2.3 吡咯烷代谢途径及分子机制
1.3.2.4 吡啶吡咯烷交叉代谢途径
1.3.2.5 五条吡咯烷途径变化途径
1.3.3 微生物尼古丁代谢相关酶的酶学研究进展
1.4 尼古丁代谢细菌的基因组学研究
1.4.1 Pseudomonas putida S16基因组
1.4.2 Pseudomonas geniculata N1基因组
1.4.3 Nocardioides sp. JS614及Rhodococcus opacus B4基因组
1.4.4 尼古丁代谢节杆菌的基因组学研究
1.5 本课题的研究意义
第二章 假单胞菌S16尼古丁下游代谢关键基因/簇分离鉴定
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 仪器、试剂和缓冲液
2.2.2 菌株、质粒和引物
2.2.3 培养基及菌株培养条件
2.2.4 分子生物学操作
2.2.5 休止细胞制备
2.2.6 HPLC检测休止细胞的降解能力
2.2.7 简并引物设计
2.2.8 进化树构建
2.2.9 总RNA提取
2.2.10 反转录PCR (RT-PCR)
2.2.11 P. putida S16电转感受态细胞制备
2.2.12 P. putida S16基因敲除菌株构建
2.3 结果与讨论
2.3.1 简并引物扩增尼古丁代谢下游基因（簇）
2.3.1.1 P. putida S16休止细胞降解 2,5-DHP
2.3.1.2 设计简并引物
2.3.1.3 摸索简并引物PCR扩增的退火温度
2.3.1.4 简并引物PCR扩增可能的目的基因
2.3.1.5 简并引物PCR产物的克隆及测序鉴定
2.3.1.6 构建hpo基因的重组表达质粒
2.3.1.7 hpo基因功能初步探索
2.3.1.8 定位尼古丁下游代谢基因簇nic2
2.3.2 nic2基因簇生物信息学分析
2.3.3 代谢物对nic基因簇各基因转录的影响
2.3.4 nic2基因簇在尼古丁代谢中的关键作用
2.3.4.1 检测P. putida S16能否降解烟酸
2.3.4.2 构建P. putida S16基因敲除突变株
2.3.4.3 各基因敲除菌株的尼古丁代谢能力
2.4 本章小结
第三章 2,5-二羟基吡啶双加氧酶（Hpo和NicX）的性质研究
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 仪器、试剂和缓冲液
3.2.2 菌株、质粒和引物
3.2.3 培养基及菌株培养条件
3.2.4 分子生物学操作
3.2.5 外源蛋白的诱导表达
3.2.6 粗酶液制备
3.2.7 带His标签蛋白的亲和纯化
3.2.8 不带标签Hpo的纯化
3.2.9 蛋白浓度测定
3.2.10 Hpo定点突变
3.2.11 酶活性检测
3.2.12 酶动力学参数确定
3.2.13 凝胶层析确定活性蛋白大小
3.2.14 O_2消耗检测
3.2.15 ~(18)O标记实验
3.2.16 非血红素Fe~(2+)依赖型双加氧酶进化树分析
3.2.17 Hpo保守序列分析
3.2.18 Hpo及其突变体Fe~(2+)结合比例测定
3.2.19 Hpo底物特异性检测
3.2.20 蛋白结构预测
3.2.21 蛋白二级结构含量分析
3.2.22 检测技术
3.3 结果与讨论
3.3.1 His-Hpo的诱导、表达和纯化
3.3.2 His-Hpo的酶学性质
3.3.2.1 His-Hpo的聚合状态
3.3.2.2 pH对His-Hpo酶活的影响
3.3.2.3 温度对His-Hpo酶活的影响
3.3.2.4 金属离子对His-Hpo酶活的影响
3.3.2.5 His-Hpo的酶动力学参数
3.3.3 无外源氨基酸的Hpo的表达纯化
3.3.4 Hpo与His-Hpo的性质比较
3.3.4.1 Hpo的聚合状态
3.3.4.2 pH、温度和金属离子对Hpo酶活的影响
3.3.4.3 Hpo的酶动力学参数
3.3.4.4 总结比较
3.3.5 Hpo的酶学性质
3.3.5.1 Hpo催化反应中的O_2消耗
3.3.5.2 Hpo催化反应产物中的O原子来源
3.3.5.3 Hpo的底物特异性
3.3.5.4 Hpo的氨基肽酶活性
3.3.5.5 Hpo的去甲酰酶活性
3.3.6 Hpo三维结构预测
3.3.7 Hpo定点突变
3.3.7.1 Hpo点突变体的表达纯化
3.3.7.2 Hpo点突变体的 2,5-DHP双加氧酶活性
3.3.7.3 Hpo及其点突变体的Fe~(2+)结合能力
3.3.7.4 Hpo及其点突变体的二级结构
3.3.8 Hpo与NicX结构与性质比较
3.3.8.1 Hpo与NicX的结构比较
3.3.8.2 Hpo与NicX的催化活性比较
3.3.8.3 Hpo与NicX的酶动力学参数比较
3.4 本章小结
第四章 NFM去甲酰酶和马来酰胺酸酰胺酶的性质研究
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 仪器、试剂和缓冲液
4.2.2 菌株、质粒和引物
4.2.3 培养基及菌株培养条件
4.2.4 分子生物学操作
4.2.5 蛋白的诱导表达、纯化及浓度测定
4.2.6 酶活性检测
4.2.7 序列比对
4.2.8 蛋白结构预测
4.2.9 检测技术
4.3 结果与讨论
4.3.1 nfo和ami基因的表达菌株构建
4.3.2 His-Nfo蛋白的纯化
4.3.3 His-Nfo的酶学性质
4.3.3.1 His-Nfo催化NFM去甲酰化生成HCOOH
4.3.3.2 His-Nfo催化NFM去甲酰化生成马来酰胺酸
4.3.3.3 His-Nfo催化NFF的去甲酰化
4.3.3.4 His-Nfo催化NFM和NFF水解的动力学参数
4.3.4 Nfo的结构预测
4.3.5 His-Ami蛋白的纯化
4.3.6 His-Ami蛋白的酶活检测
4.4 本章小结
第五章 尼古丁代谢节杆菌M2012083比较基因组分析
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株M2012083的来源与保藏
5.2.2 菌株M2012083的培养
5.2.3 菌株M2012083基因组提取
5.2.4 16S rDNA进化树构建
5.2.5 菌株鉴定
5.2.6 基因组测序及组装
5.2.7 基因组注释
5.2.8 比较基因组分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 菌株M2012083的鉴定
5.3.2 节杆菌M2012083的基因组信息
5.3.3 七株节杆菌的基因组比较
5.3.4 节杆菌M2012083中尼古丁代谢相关基因
5.3.5 节杆菌M2012083中压力应答相关基因
5.3.5.1 渗透压力应答
5.3.5.2 氧化压力应答
5.3.5.3 冷或热激应答
5.3.5.4 脱毒作用
5.3.5.5 其他压力应答蛋白
5.4 本章小结
结论与展望
创新点
参考文献
附录I 仪器设备
附录II 主要试剂
附录III 缓冲液
附录IV 菌株及质粒
附录V 引物信息
附录VI 标准曲线
附录VII 七株节杆菌中的压力应答蛋白
致谢
攻读博士期间（待）发表论文及所获奖励
本文编号：3679833
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【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略表
第一章 前言
1.1 氮杂环污染物概述
1.2 尼古丁及其环境污染
1.2.1 尼古丁的基本性质
1.2.2 尼古丁的毒害作用
1.2.3 环境中的尼古丁污染
1.3 微生物尼古丁代谢机制研究进展
1.3.1 尼古丁代谢微生物
1.3.2 微生物代谢尼古丁的途径及分子机制
1.3.2.1 脱甲基代谢途径
1.3.2.2 吡啶代谢途径及分子机制
1.3.2.3 吡咯烷代谢途径及分子机制
1.3.2.4 吡啶吡咯烷交叉代谢途径
1.3.2.5 五条吡咯烷途径变化途径
1.3.3 微生物尼古丁代谢相关酶的酶学研究进展
1.4 尼古丁代谢细菌的基因组学研究
1.4.1 Pseudomonas putida S16基因组
1.4.2 Pseudomonas geniculata N1基因组
1.4.3 Nocardioides sp. JS614及Rhodococcus opacus B4基因组
1.4.4 尼古丁代谢节杆菌的基因组学研究
1.5 本课题的研究意义
第二章 假单胞菌S16尼古丁下游代谢关键基因/簇分离鉴定
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 仪器、试剂和缓冲液
2.2.2 菌株、质粒和引物
2.2.3 培养基及菌株培养条件
2.2.4 分子生物学操作
2.2.5 休止细胞制备
2.2.6 HPLC检测休止细胞的降解能力
2.2.7 简并引物设计
2.2.8 进化树构建
2.2.9 总RNA提取
2.2.10 反转录PCR (RT-PCR)
2.2.11 P. putida S16电转感受态细胞制备
2.2.12 P. putida S16基因敲除菌株构建
2.3 结果与讨论
2.3.1 简并引物扩增尼古丁代谢下游基因（簇）
2.3.1.1 P. putida S16休止细胞降解 2,5-DHP
2.3.1.2 设计简并引物
2.3.1.3 摸索简并引物PCR扩增的退火温度
2.3.1.4 简并引物PCR扩增可能的目的基因
2.3.1.5 简并引物PCR产物的克隆及测序鉴定
2.3.1.6 构建hpo基因的重组表达质粒
2.3.1.7 hpo基因功能初步探索
2.3.1.8 定位尼古丁下游代谢基因簇nic2
2.3.2 nic2基因簇生物信息学分析
2.3.3 代谢物对nic基因簇各基因转录的影响
2.3.4 nic2基因簇在尼古丁代谢中的关键作用
2.3.4.1 检测P. putida S16能否降解烟酸
2.3.4.2 构建P. putida S16基因敲除突变株
2.3.4.3 各基因敲除菌株的尼古丁代谢能力
2.4 本章小结
第三章 2,5-二羟基吡啶双加氧酶（Hpo和NicX）的性质研究
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.2.1 仪器、试剂和缓冲液
3.2.2 菌株、质粒和引物
3.2.3 培养基及菌株培养条件
3.2.4 分子生物学操作
3.2.5 外源蛋白的诱导表达
3.2.6 粗酶液制备
3.2.7 带His标签蛋白的亲和纯化
3.2.8 不带标签Hpo的纯化
3.2.9 蛋白浓度测定
3.2.10 Hpo定点突变
3.2.11 酶活性检测
3.2.12 酶动力学参数确定
3.2.13 凝胶层析确定活性蛋白大小
3.2.14 O_2消耗检测
3.2.15 ~(18)O标记实验
3.2.16 非血红素Fe~(2+)依赖型双加氧酶进化树分析
3.2.17 Hpo保守序列分析
3.2.18 Hpo及其突变体Fe~(2+)结合比例测定
3.2.19 Hpo底物特异性检测
3.2.20 蛋白结构预测
3.2.21 蛋白二级结构含量分析
3.2.22 检测技术
3.3 结果与讨论
3.3.1 His-Hpo的诱导、表达和纯化
3.3.2 His-Hpo的酶学性质
3.3.2.1 His-Hpo的聚合状态
3.3.2.2 pH对His-Hpo酶活的影响
3.3.2.3 温度对His-Hpo酶活的影响
3.3.2.4 金属离子对His-Hpo酶活的影响
3.3.2.5 His-Hpo的酶动力学参数
3.3.3 无外源氨基酸的Hpo的表达纯化
3.3.4 Hpo与His-Hpo的性质比较
3.3.4.1 Hpo的聚合状态
3.3.4.2 pH、温度和金属离子对Hpo酶活的影响
3.3.4.3 Hpo的酶动力学参数
3.3.4.4 总结比较
3.3.5 Hpo的酶学性质
3.3.5.1 Hpo催化反应中的O_2消耗
3.3.5.2 Hpo催化反应产物中的O原子来源
3.3.5.3 Hpo的底物特异性
3.3.5.4 Hpo的氨基肽酶活性
3.3.5.5 Hpo的去甲酰酶活性
3.3.6 Hpo三维结构预测
3.3.7 Hpo定点突变
3.3.7.1 Hpo点突变体的表达纯化
3.3.7.2 Hpo点突变体的 2,5-DHP双加氧酶活性
3.3.7.3 Hpo及其点突变体的Fe~(2+)结合能力
3.3.7.4 Hpo及其点突变体的二级结构
3.3.8 Hpo与NicX结构与性质比较
3.3.8.1 Hpo与NicX的结构比较
3.3.8.2 Hpo与NicX的催化活性比较
3.3.8.3 Hpo与NicX的酶动力学参数比较
3.4 本章小结
第四章 NFM去甲酰酶和马来酰胺酸酰胺酶的性质研究
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.2.1 仪器、试剂和缓冲液
4.2.2 菌株、质粒和引物
4.2.3 培养基及菌株培养条件
4.2.4 分子生物学操作
4.2.5 蛋白的诱导表达、纯化及浓度测定
4.2.6 酶活性检测
4.2.7 序列比对
4.2.8 蛋白结构预测
4.2.9 检测技术
4.3 结果与讨论
4.3.1 nfo和ami基因的表达菌株构建
4.3.2 His-Nfo蛋白的纯化
4.3.3 His-Nfo的酶学性质
4.3.3.1 His-Nfo催化NFM去甲酰化生成HCOOH
4.3.3.2 His-Nfo催化NFM去甲酰化生成马来酰胺酸
4.3.3.3 His-Nfo催化NFF的去甲酰化
4.3.3.4 His-Nfo催化NFM和NFF水解的动力学参数
4.3.4 Nfo的结构预测
4.3.5 His-Ami蛋白的纯化
4.3.6 His-Ami蛋白的酶活检测
4.4 本章小结
第五章 尼古丁代谢节杆菌M2012083比较基因组分析
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.2.1 菌株M2012083的来源与保藏
5.2.2 菌株M2012083的培养
5.2.3 菌株M2012083基因组提取
5.2.4 16S rDNA进化树构建
5.2.5 菌株鉴定
5.2.6 基因组测序及组装
5.2.7 基因组注释
5.2.8 比较基因组分析
5.3 结果与讨论
5.3.1 菌株M2012083的鉴定
5.3.2 节杆菌M2012083的基因组信息
5.3.3 七株节杆菌的基因组比较
5.3.4 节杆菌M2012083中尼古丁代谢相关基因
5.3.5 节杆菌M2012083中压力应答相关基因
5.3.5.1 渗透压力应答
5.3.5.2 氧化压力应答
5.3.5.3 冷或热激应答
5.3.5.4 脱毒作用
5.3.5.5 其他压力应答蛋白
5.4 本章小结
结论与展望
创新点
参考文献
附录I 仪器设备
附录II 主要试剂
附录III 缓冲液
附录IV 菌株及质粒
附录V 引物信息
附录VI 标准曲线
附录VII 七株节杆菌中的压力应答蛋白
致谢
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