水稻中两个籽粒镉积累相关基因的功能研究

发布时间：2023-01-25 19:11

　　我国南方稻区普遍存在重金属镉（Cd）污染的问题,因此,Cd污染稻田生产的稻米存在Cd超标的风险（＞0.2mg/kg）。长期食用Cd超标的大米对人体健康有潜在的危害。由于通过各种修复手段把Cd等重金属从环境中移除,是一个长期而艰辛的工作,因此,培育籽粒Cd低积累水稻品种是解决大米Cd安全的有效手段之一。近几年,在植物Cd吸收、转运相关基因的研究取得了一定进展,然而,有关水稻吸收、转运和积累Cd的分子和生理机制,尤其是水稻籽粒积累Cd的机制,还很不清楚。因此,进一步鉴定Cd积累相关基因,研究其生理功能,可以加深对水稻Cd运输和积累遗传机制的理解,也为通过遗传调控,培育籽粒低镉水稻种质资源提供指导。水稻的根和茎节在离子吸收和籽粒Cd积累中起关键的作用。本研究通过对根和茎节的转录组和Cd候选基因的酵母突变体功能分析,筛选出与Cd耐性相关的基因OsCCX2和OsMDR6,进一步研究它们在水稻Cd积累中的作用及其生理功能。同时,对Cd积累相关基因与温敏不育系水稻籽粒Cd积累的关联性进行分析,获得的主要结果如下:1.OsCCX2参与水稻Cd积累调控。首先,通过CRISPR/cas9基因编辑方法,构建... 

【文章页数】：160 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
    1.1 Cd对植物的毒害作用
        1.1.1 Cd对植物光合和呼吸作用的影响
        1.1.2 Cd对细胞超微结构的影响
        1.1.3 Cd对植物细胞膜的影响
        1.1.4 Cd对植物酶活性的影响
        1.1.5 Cd对植物DNA及细胞的分裂影响
    1.2 植物响应Cd胁迫的信号网络
        1.2.1 钙-钙调素系统信号通路对Cd胁迫的响应
        1.2.2 激素对Cd胁迫的响应
        1.2.3 活性氧的信号传导
        1.2.4 MAPK级联网络
    1.3 植物对Cd吸收和运输的研究进展
        1.3.1 ABC转运蛋白家族
        1.3.2 CDF转运蛋白家族
        1.3.3 HMA转运蛋白家族
        1.3.4 CaCA转运蛋白家族
        1.3.5 NRAMP转运蛋白家族
        1.3.6 其他运输蛋白家族
    1.4 候选基因与性状关联分析
        1.4.1 核苷酸多态性
        1.4.2 连锁不平衡
        1.4.3 基于候选基因关联分析的策略和特点
    1.5 本研究的目的与意义
第二章 水稻Cd相关运输基因OsCCX2、OsMDR6的筛选与初步鉴定
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验材料
        2.1.2 仪器及试剂
        2.1.3 培养基及缓冲液配制
        2.1.4 Illumina测序
        2.1.5 水稻组织总RNA提取
        2.1.6 酵母感受态细胞的制备及转化方法
        2.1.7 酵母体外功能互补实验
        2.1.8 半定量RT-PCR和q-RT-PCR
    2.2 结果与分析
        2.2.1 水稻节中特异的高表达的运输基因的筛选
        2.2.2 水稻节中候选基因的表达量验证
        2.2.3 OsCCX2对酵母镉耐受性的影响研究
        2.2.4 水稻根中高表达的运输基因的筛选
        2.2.5 水稻根中高表达基因的表达量验证
        2.2.6 OsMDR6对酵母Cd耐受性的影响
    2.3 讨论
第三章 OsCCX2基因参与水稻Cd运输和积累的研究
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 仪器、试剂
        3.1.3 培养基及缓冲液配制
        3.1.4 实验材料处理方法
        3.1.5 水稻基因组DNA的提取方法
        3.1.6 相关载体的基本构建方法
        3.1.7 转基因水稻的遗传转化方法
        3.1.8 金属离子检测方法
        3.1.9 启动子活性的GUS组织染色分析方法
        3.1.10 GUS转基因植株石蜡切片方法
        3.1.11 利用拟南芥叶肉细胞原生质体瞬时表达目的蛋白
        3.1.12 大肠杆菌TOP10感受态细胞的制备方法
        3.1.13 农杆菌EHA105感受态细胞的制备及转化方法
        3.1.14 木质部、韧皮部汁液收集方法
        3.1.15 亚细胞组分的分离方法
        3.1.16 其他实验方法
    3.2 结果与分析
        3.2.1 OsCCX2基因的表达模式分析
        3.2.2 OsCCX2基因敲除材料的获得和鉴定
        3.2.3 OsCCX2基因突变对水稻籽粒Cd积累的影响
        3.2.4 OsCCX2基因突变对Cd的根-茎转运率的影响
        3.2.5 OsCCX2基因突变对Cd在地上部分分配的影响
        3.2.6 OsCCX2基因突变对木质部中Cd运输的影响
        3.2.7 OsCCX2基因突变对Cd亚细胞分布的影响
        3.2.8 OsCCX2基因的亚细胞定位研究
    3.3 讨论
第四章 OsCCX2参与植物细胞内钙离子稳态的初步研究
    4.1 材料与方法
        4.1.1 实验材料
        4.1.2 拟南芥花药染色观察
        4.1.3 NMT技术检测Ca离子流的方法
        4.1.4 OsCCX2过表达载体构建
        4.1.5 OsCCX2过表达转基因植株的获得方法
        4.1.6 其他实验方法
    4.2 结果与分析
        4.2.1 OsCCX2对细胞静息态Ca离子流的影响
        4.2.2 OsCCX2过表达对盐胁迫下的Ca信号的影响
        4.2.3 OsCCX2表达量对植株中Ca/Na含量的影响
        4.2.4 OsCCX2基因突变对Ca在地上部分分配的影响
        4.2.5 OsCCX2基因突变对干旱和高Ca胁迫的影响
        4.2.6 OsCCX2过表达对植株生长发育的影响
        4.2.7 OsCCX2受盐胁迫的诱导
    4.3 讨论
第五章 水稻OsMDR6基因功能的初步研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 实验方法
    5.2 结果与分析
        5.2.1 Cd胁迫对OsMDR6基因表达的影响
        5.2.2 OsMDR6基因突变对水稻籽粒Cd积累的影响
        5.2.3 OsMDR6基因突变对Fe含量及敏感性的影响
        5.2.4 OsMDR6基因突变对缺Fe响应基因表达的影响
        5.2.5 OsMDR6基因突变对生长素反应的影响
        5.2.6 OsMDR6基因突变对生长素响应基因表达的影响
        5.2.7 OsMDR6基因突变对种子大小调控的影响
        5.2.8 OsMDR6的亚细胞定位研究
    5.3 讨论
第六章 Cd积累相关基因与水稻温敏核不育系籽粒Cd积累的关联分析
    6.1 材料与方法
        6.1.1 实验材料
        6.1.2 实验方案设计
        6.1.3 PCR扩增及引物的可行性分析
        6.1.4 聚丙稀酰胺凝胶电泳
        6.1.5 扩增产物的带型读取
        6.1.6 水稻温敏不育系群体结构及遗传多样性分析方法
        6.1.7 Cd积累相关基因序列检测
        6.1.8 水稻温敏不育系序列多态性分析
        6.1.9 水稻温敏不育系籽粒低Cd相关基因关联分析
        6.1.10 Cd积累基因等位变异位点的表型效应分析
        6.1.11 其他实验方法
    6.2 结果与分析
        6.2.1 水稻温敏核不育系材料籽粒镉含量检测分析
        6.2.2 水稻温敏不育系群体结构分析
        6.2.3 水稻Cd积累相关基因序列多态性分析
        6.2.4 水稻Cd积累相关基因与不育系籽粒Cd积累性状关联分析
        6.2.5 Cd积累基因等位变异位点的表型效应分析
    6.3 讨论
结语
缩略词表
参考文献
附录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]外源表油菜素内酯（2,4-EBL）对镉 （Cd）胁迫下番茄幼苗的缓解效应[J]. 袁博,金晓霞,肖玮,于丽杰.  分子植物育种. 2018(09)
[2]植物响应重金属镉胁迫的耐性机理研究进展[J]. 时萌,王芙蓉,王棚涛.  生命科学. 2016(04)
[3]Cd胁迫对水稻生长及内源激素含量的影响[J]. 游来勇,王昌全,罗娟,李冰,曾建.  生态环境学报. 2015(05)
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[5]玉米dbf1基因与耐旱相关性状的关联分析[J]. 苏治军,郝转芳,谢传晓,李明顺,石红良,吴永升,张世煌,李新海.  植物遗传资源学报. 2010(04)
[6]镉胁迫对玉米幼苗抗氧化系统及光合作用的影响[J]. 黄辉,李升,郭娇丽.  农业环境科学学报. 2010(02)
[7]外源钙对镉胁迫下芥菜型油菜幼苗生长和生理特性的影响[J]. 刘丽莉,冯涛,向言词,肖璐,严明理.  农业环境科学学报. 2009(05)
[8]Zn/Cd超富集植物天蓝遏蓝菜（Thlaspi caerulescens）中TcCaM2基因的克隆及在酵母中的重金属耐受性分析[J]. 韩璐,魏嵬,官子楸,徐进,柴团耀.  中国科学院研究生院学报. 2007(04)
[9]西南喀斯特地区土壤退化过程与机理探讨[J]. 赵中秋,后立胜,蔡运龙.  地学前缘. 2006(03)
[10]镉引起蚕豆（Vicia faba）叶片DNA损伤和细胞凋亡研究[J]. 张旭红,林爱军,苏玉红,朱永官.  环境科学. 2006(04)

博士论文
[1]农田生态系统镉污染研究[D]. 王凯荣.华中农业大学 2004

硕士论文
[1]水稻钙调蛋白对镉胁迫的分子响应[D]. 张国君.福建农林大学 2013
[2]477份常规水稻品种的遗传多样性和群体结构分析[D]. 徐兰兰.江西农业大学 2012



本文编号：3731693