大豆乳清废水中β-淀粉酶的分离纯化、性质及应用研究

发布时间：2017-06-04 03:10

  本文关键词：大豆乳清废水中β-淀粉酶的分离纯化、性质及应用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：作为一种重要的食品原料,大豆分离蛋白被普遍的应用于食品行业中。随着大豆蛋白产业的快速发展,采用碱溶酸沉工艺每生产1t大豆分离蛋白会产生35-65t大豆乳清废水。经过对乳清废水成分的分析,发现乳清废水中具有较高的p-淀粉酶活性,p-淀粉酶的来源有高等植物来源和微生物来源,与微生物来源的p-淀粉酶相比,植物来源的p-淀粉酶酶活力高、耐热性好并且pH作用范围宽,能更好的应用于食品工业生产过程中。对大豆乳清废水中的p-淀粉酶进行研究是一项有意义的课题,不仅可以增加经济效益,而且可以延长豆制品产业链。本文先用MALDI-TOF/TOF质谱法对大豆乳清蛋白成分进行鉴定,然后用Hitrap QFF阴离子色谱柱和HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱柱对p-淀粉酶进行纯化,对纯化后的p-淀粉酶进行酶学性质研究,根据酶学性质的研究结果,对p-淀粉酶的工业化生产方法进行初步的探索,最后将本文制得的p-淀粉酶酶液与市售p-淀粉酶酶液在应用上做比较。主要研究结果如下：1、MALDI-TOF/TOF对大豆乳清废水中乳清蛋白的鉴定结果表明在大豆乳清废水中主要含有四种蛋白成分：即脂肪氧合酶、β-淀粉酶、大豆血球凝集素、胰蛋白酶抑制剂。2、对Hitrap QFF阴离子色谱柱纯化β-淀粉酶的条件进行优化,选择pH值为8.0的Tris-HCI缓冲液、0.8mL/min的流速、0.12M NaCl梯度洗脱p-淀粉酶、1.0MNaCI梯度洗脱杂蛋白作为阴离子纯化p-淀粉酶的条件；阴离子色谱纯化后再经过HiPrep 26/60 Sephacryl S-100 HR凝胶过滤色谱柱对β-淀粉酶进行进一步的纯化,流动相为50Mm, pH6.0的NaAC缓冲液,流速0 .8mL/min。与大豆乳清废水中的p-淀粉酶相比,纯化后的p-淀粉酶得率为17.32%,酶活纯度提高了16.49倍,比酶活为29735.92 U/mg。3、对纯化后的p-淀粉酶进行酶学性质分析,结果表明p-淀粉酶分子量为55.98kDa,等电点为4.87,最适反应温度为55℃,并且在低温(50℃)下较为稳定,最适反应pH为6.0,有较宽的pH作用范围,并且在pH值4.0-8.0之间较为稳定。研究金属离子、表面活性剂、抑制剂对p-淀粉酶的作用效果发现K+、Ba2+、 Ca2+、Na+对β-淀粉酶活性没有显著性作用(P0.05),EDTA、Mn2+、Fe3+;对p-淀粉酶的活性有一定抑制作用(P0.05),而Cu2+、表面活性剂SDS及抑制剂p-巯基乙醇对p-淀粉酶活性有较大抑制作用(P0.01)。Zn2+、Mg2+、Li+;对p-淀粉酶活性有一定的激活作用(P0.05),抑制剂PMSF及表面活性剂Tween-20, Tween-40、Tween-60、Tween-80和Tritonx-100对p-淀粉酶活性有较强的激活作用(P0.01)。通过测定β-淀粉酶对不同底物的相对酶活,确定p-淀粉酶的最适底物为马铃薯淀粉,并且以马铃薯淀粉为底物,测定β-淀粉酶的动力学参数Km值为4.8 mg/mL, Vmax为12.10units/minute/mL。4、根据β-淀粉酶的酶学性质,应用超滤法、硫酸铵盐析法、乙醇沉淀法、单宁酸沉淀法对β-淀粉酶的工业化生产进行研究。将超滤法与单宁酸沉淀法相结合,酶活得率为61.88%,比酶活为3138.92U/mg；将超滤法与乙醇沉淀法相结合,β-淀粉酶得率为77.54%,比酶活为5052.21U/mg。采用超滤后乙醇沉淀的方法可以有效的从大豆乳清废水中实现β-淀粉酶的工业化生产,单位酶活可以达到150000U/mL。5、将本文制备的大豆p-淀粉酶与市售β-淀粉酶相比较,结果表明大豆p-淀粉酶粗酶液最适反应温度为55℃,而市售β-淀粉酶的最适反应温度为50℃,高温(50-70℃)下市售的p-淀粉酶稳定性较大豆来源的p-淀粉酶稳定性差,在70℃高温下放置1h,两种p-淀粉酶活性都完全丧失,酶活都为0；两种p-淀粉酶有较宽的pH值适应范围(pH4.0-9.0),最适反应pH值均为pH6.0。两种p-淀粉酶最适反应温度及温度稳定性的不同也反应在了二者的应用效果上面,将两种β-淀粉酶对面制品分别进行抗回生处理,以面制品硬度为指标,当酶作用温度为55℃、60℃、65℃时,大豆p-淀粉酶在抑制面制品回生方面具有明显的优势。
【关键词】：大豆乳清废水 蛋白质鉴定 β-淀粉酶 纯化 酶学性质 工业化 应用
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：X792;TS201.25
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 绪论13-22
• 1 前言13
• 2 大豆乳清废水中的主要成分13-14
• 3 β-淀粉酶的研究概况14-18
• 3.1 β-淀粉酶的来源14-15
• 3.2 β-淀粉酶的结构及作用机理15-16
• 3.3 β-淀粉酶的纯化16-17
• 3.4 β-淀粉酶的酶学性质17-18
• 4 β-淀粉酶的工业化生产方法18-19
• 5 β-淀粉酶的应用19-20
• 6 立题意义20-21
• 7 本文主要研究内容21-22
• 第二章 大豆乳清蛋白成分鉴定22-34
• 1 前言22
• 2 材料与方法22-24
• 2.1 材料22-23
• 2.2 仪器23
• 2.3 实验方法23-24
• 3 实验结果24-33
• 3.1 大豆乳清成分分析24
• 3.2 条带1 MODI-TOF/TOF鉴定24-27
• 3.3 条带2 MODI-TOF/TOF鉴定27-29
• 3.4 条带3 MODI-TOF/TOF鉴定29-31
• 3.5 条带4 MODI-TOF/TOF鉴定31-33
• 4 本章小结33-34
• 第三章 β-淀粉酶的纯化方法研究34-53
• 1 前言34
• 2 材料与方法34-37
• 2.1 材料34-35
• 2.2 仪器35
• 2.3 方法35-37
• 3 实验结果与分析37-51
• 3.1 HiTrap SPFF 1mL阳离子色谱柱与HiTrap QFF 1mL阴离子色谱柱纯化β-淀粉酶结果的比较37-40
• 3.2 HiTrap QFF 1mL阴离子色谱柱对β-淀粉酶纯化条件的优化40-44
• 3.3 阴离子交换层析用梯度洗脱纯化β-淀粉酶条件的优化44-48
• 3.4 β-淀粉酶纯化条件的确定48-51
• 4 本章小结51-53
• 第四章 β-淀粉酶酶学性质分析53-66
• 1 前言53
• 2 材料与方法53-56
• 2.1 材料53-54
• 2.2 仪器54
• 2.3 方法54-56
• 3 实验结果与分析56-65
• 3.1 高分辨MALDI-TOF测定β-淀粉酶分子量56-57
• 3.2 β-淀粉酶等电点测定57-58
• 3.3 β-淀粉酶的最适反应温度和温度稳定性58-60
• 3.4 β-淀粉酶的最适反应pH值及pH值稳定性60-61
• 3.5 金属离子、抑制剂对β-淀粉酶的影响61-62
• 3.6 表面活性剂对β-淀粉酶酶活力的作用效果62-63
• 3.7 β-淀粉酶的底物特异性研究63-64
• 3.8 β-淀粉酶的酶促动力学参数测定64-65
• 4 本章小结65-66
• 第五章 β-淀粉酶工业化生产方法探索66-84
• 1 前言66-67
• 2 材料与方法67-69
• 2.1 材料67
• 2.2 仪器67
• 2.3 方法67-69
• 3 实验结果与分析69-83
• 3.1 β-淀粉酶单一工业化生产方法的探索69-79
• 3.2 超滤法和单宁酸沉淀法相结合与超滤法和酒精沉淀法相结合的比较79-83
• 4 本章小结83-84
• 第六章 β-淀粉酶在面制品上的应用84-98
• 1 前言84
• 2 材料与方法84-86
• 2.1 材料84
• 2.2 仪器84
• 2.3 方法84-86
• 3 实验结果与分析86-96
• 3.1 大豆β-淀粉酶与市售β-淀粉酶在温度及pH方面的比较86-90
• 3.2 两种β-淀粉酶酶液对面制品硬度的影响90-92
• 3.3 响应面法优化大豆β-淀粉酶抑制面粉回升工艺条件92-96
• 4 本章小结96-98
• 全文总结与展望98-101
• 参考文献101-105
• 附录一 大豆乳清蛋白成分鉴定二级质谱图105-109
• 附录二109-110
• 致谢110

【参考文献】

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