元基因组文库中食品工业酶基因的筛选及脱卤酶的克隆表达

发布时间：2017-11-27 19:22

  本文关键词：元基因组文库中食品工业酶基因的筛选及脱卤酶的克隆表达

  更多相关文章： 碱性池 微生物多样性 食品用酶 脱卤酶

【摘要】：元基因组文库指的是从环境中直接提取混合微生物的基因组DNA克隆到宿主细胞中,构建得到的基因组文库或cDNA文库,相比传统的培养方法,元基因组文库可以更全面的认识和获得环境中的微生物基因资源,而这些微生物基因资源可以为新资源食品应用,医药开发等工业应用奠定基础。长期在碱性环境中生存的微生物进化出了独特的适应机制,体内可能拥有极端嗜碱酶基因,对这些嗜碱微生物进行多样性的分析以及功能基因的筛选,有助于我们了解极端环境下微生物的代谢机制,并获得具有食品应用价值的极端嗜碱酶基因。脱卤酶能够催化有机卤素化合物中碳-卤键裂解,使卤素原子从化合物中释放出来。脱卤酶能够通过去除有机氯农药中的氯,从而消除其毒性,这对治理我国曾大量使用过的有机氯农药(二氯苯氧基乙酸、三氯苯酚、六六六等)的残留问题具有重要应用价值。脱卤酶可应用于粮食、蔬菜、水果,茶叶以及中成药中含氯农药残留的清除和检测；脱卤酶还可应用于含氯毒剂(芥子气)的脱毒处理,这对于一些遗留化合物无害处理,保护环境安全具有重要意义。当前已发现的脱卤酶由于在催化活性、酶稳定性、产率等方面具有很大缺陷,因此开发新一代高活力,高稳定性以及高效表达的脱卤酶具有重要应用价值和社会意义。本论文作了如下研究：对湖南沅江明星麻厂碱性池进行了样品采集,提取土壤总DNA,用16SrRNA的方法分析了该池微生物多样性。分析结果表明,该微生物类群包含变形菌门、厚壁菌门以及拟杆菌门的细菌以及广古菌门的古菌。其中细菌的优势菌种BacA1和BacB1与Sulfuropirillum alkalitolerans和Shewanella putrefacien s的相似性分别为98%和98%。另一个优势细菌BacB1与Shewanella putrefaciens以及 Shewanella hafniensis相似性均为98%；优势古菌甲烷八叠球菌Methanosarcinamazei为厌氧产甲烷古菌。可以利用H2/C02、醋酸盐、甲醇、甲胺、三甲胺为碳源产生甲烷。在有机污染物厌氧发酵环境广泛存在,是厌氧沼气池中的重要功能菌群。而在pH9的环境中,该古菌的存在鲜有报道,是否在原位发挥功能需要进一步的验证。构建湖南沅江麻厂碱性池的元基因组的质粒文库,并保存了19200个克隆。对碱性池Fosmid文库进行活性酶基因的筛选,总计筛选了7680个克隆子,共筛选了6种酶：淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶、木聚糖酶。并对其做了复筛,最后的复筛结果为：有淀粉酶活性的36个(强阳性4个)、脂肪酶9个(强阳性2个)、蛋白酶4个(强阳性1个)、纤维素4个(强阳性1个)。表明该环境大分子有机质降解基因含量相对丰富,并且由于其独特的碱性环境,筛选到的新酶可能同时具有嗜碱或耐碱的特性,为后续的工业应用提供了良好的基因资源。从深海热液区分离来源的锰氧化黄氏菌Huangia manganoxydans 8047中克隆了5个脱卤酶基因,并成功使其在大肠杆菌表达系统中高效表达。重点分析了DhmB脱卤酶的生化性质：表达纯化后的蛋白经SDS-PAGE检测为单一条带,酶学性质分析结果表明：DhmB脱卤酶是一类稳定性较强的酶,它的最适反应温度65℃,解链温度为68.8℃,耐受中高温的影响,在50℃以内处理,酶活没什么影响,40%二甲基亚砜、30%甲醇、20%的乙醇和乙腈处理,DhmB表现出强的溶剂稳定性,能降解低碳链的有机卤素化合物,能降解经典农药(如DTT,六六六等),能降解芥子气等化学毒剂。DhmB基因与已报道的的所有的脱卤酶基因相似性最高的只有63%(Aurantimonas manganoxydans SI85-9A1),属于新基因,锰氧化黄氏菌Huangia manganoxydans8047因其本身来源于低温环境,属于低温菌的一类,但是其基因组上脱卤酶基因表达的蛋白却属于中高温酶,为我们未来更深入的研究这类酶提出科学问题,也为未来使其在工业应用,制药应用,食品安全应用中提供更好的理论基础。
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.25

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本文编号：1232909