microRNA光电化学检测及应用研究

发布时间：2017-12-13 08:28

  本文关键词：microRNA光电化学检测及应用研究

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【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一类内源性的非蛋白编码的RNA,它们广泛存在于动植物体中,并且可以在动植物生长的不同阶段调控着一些基因的表达。其主要通过与这些基因的信使RNA的特定区域互补杂交而引起后者的降解或翻译抑制,从而在基因转录后调控基因的表达水平。许多研究报道已经证实,miRNA表达异常与很多疾病的发生和植物个体的生长有着直接或者间接的关系,例如:各种癌症等。但由于动植物体内成熟的miRNA很小,核酸序列相似度非常高,并且在细胞中的表达水平非常低,这便使得对miRNA的检测异常困难。目前,miRNA的检测方法主要有Northern blotting法、微阵列芯片法、实时荧光定量PCR法等。Northern blotting操作复杂、耗费人力、而且灵敏度较低,分析检测时样品的需求量较大并且需要多步的分离富集,其对RNase的污染也非常敏感。微阵列芯片的生产制作和检测消耗的成本较高,每个芯片上所检测的样品体积很小,这大大降低了其灵敏度。实时荧光定量PCR的选择性较低并会放大非线性目标,这将会导致对基因表达检测的失真,因此该方法主要用于定量检测miRNA前体的表达,而不常用于定量检测成熟的miRNA表达。综上所述,建立准确性好,灵敏度高,操作简单的miRNA检测方法意义重大。本文基于Bi2S3-纳米金复合材料和钨酸铜-氧化铜复合材料以及T7核酸外切酶等特异性功能,并结合酶催化、酶循环放大等技术,制备了三种电化学生物传感器,实现了miRNA的超灵敏检测。(1)基于硫化铋-纳米金复合光电材料、双螺旋特异性核酸酶(DSN)以及碱性磷酸酯酶催化底物原位生成电子供体的信号扩增技术,制备了一种灵敏的光电化学生物传感器,实现对microRNA-21的高灵敏性和高选择性检测,并将该方法成功应用于检测感染禽白血病病毒细胞中microRNA-21的表达水平的变化。以ITO为基体电极,硫化铋为光电转换材料,纳米金为光电子转移促进剂,生物素修饰的DNA为探针。该探针与microRNA-21杂交后,形成刚性双链。再通过生物素与亲和素之间的特意相互作用,将亲和素链接的碱性磷酸酯酶修饰到电极上。通过碱性磷酸酯酶对L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的水解作用,产生电子供体抗坏血酸。本实验使用能够特异性水解DNA-RNA杂交体中DNA的DSN酶来水解固定在电极表面的探针DNA,从而使microRNA-21释放出来。释放出来的microRNA-21继续和未杂交的探针DNA杂交,形成等温循环扩增。经过DSN酶水解后,电极表面的探针DNA数量减少,进而减少了碱性磷酸酯酶的修饰量,光电流降低。研究发现,microrna-21浓度的对数值在1-500fm范围内与光电流成反比关系,检测限为0.35fm。该传感器还实现了对感染了不同时间的禽白血病病毒的细胞中提取的总rna中microrna-21表达量的检测,结果表明随着感染病毒时间的增加microrna-21在染病细胞中的表达下调。本研究所提出的这种新型的检测microrna-21策略开发出了光电化学生物传感器在可见光照射下检测寡聚核苷酸的新方法。(2)基于t4rna连接酶2和t7核酸外切酶,利用两步等温循环扩增的方法构建了一种新型电化学生物传感器来灵敏检测microrna-21,并成功用于检测正常人与胃癌患者血清中microrna-21的表达水平差异。microrna-21、dna2与dna1杂交后,t4rna连接酶2将microrna和dna2连接起来,此时,t7核酸外切酶水解双链中的dna1,释放出连接反应产生的单链核酸又可以与完整的dna1杂交,形成等温循环扩增。当反应剩余的dna1与dna3混合后,两者便会互补杂交,此时t7核酸外切酶水解消化dna3,释放出dna1,又与dna3杂交,再次形成等温循环扩增。最后,将反应剩余的dna3固定在金电极表面。使用dpv检测标记在dna3上的电化学响应分子—二茂铁。以此,microrna-21的浓度就可以通过检测二茂铁的氧化电流的变化来实现。该方法的检测限可以达到0.36fm,检测范围为1-105fm。实验结果表明,胃癌患者血清中microrna-21的表达水平较正常人血清中的明显上调。因此,microrna-21可作为诊断胃癌的新型标志物。本研究为microrna的检测、胃癌的预防及诊断提供了新的途径。(3)以钨酸铜-氧化铜复合材料为光电响应材料,将其修饰在导电玻璃上作为检测电极。利用滚环扩增反应,磷酸根与phos-tag的特异性识别以及生物素和亲和素的特异性识别作用以及碱性磷酸酯酶水解l-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐产生抗坏血酸作为电子供体,构建了一种灵敏光电化学生物传感器,可以灵敏检测microrna-319a,并将其成功应用于检测外源植物激素对水稻幼苗叶片中的microrna-319a表达水平的影响。通过x-射线衍射(xrd)和扫描电镜图谱(sem)对所制备的钨酸铜-氧化铜进行表征,结果表明所制备的材料具有较好的三斜晶型。从实验结果可以计算出光暗电流差值与目标核苷酸浓度之间的线性关系为?i(na)=69.61logc(fm)+33.36,检测限为0.13fm(s/n=3)。实验结果表明,赤霉素使水稻幼苗叶片中microrna-319a的表达上调,脱落酸和6-苄基嘌呤使microrna-319a表达下调,而吲哚乙酸和吲哚丙酸则对microrna-319a表达基本没有影响。这说明mirna-319a会参与赤霉素,脱落酸和6-苄基嘌呤这些植物激素的调节网络,而不会参与吲哚乙酸和吲哚丙酸的调节网络。这为研究microRNA参与植物激素调控水稻幼苗叶片发育的路径提供了新的研究方法和技术。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O657

【参考文献】

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本文编号：1284497