基于DNAzyme和EXO Ⅲ信号扩增技术构建高灵敏的电化学发光生物传感器及其应用研究

发布时间：2017-12-22 20:37

本文关键词：基于DNAzyme和EXO Ⅲ信号扩增技术构建高灵敏的电化学发光生物传感器及其应用研究　出处：《华东师范大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：电化学发光(Electrogenerated Chemiluminescence,ECL)又称电致化学发光,是电化学和化学发光相结合的产物,由于具有操作简单快速、时空可控性好、检测灵敏度高等优点,已经成为分析科学最热门的领域之一。传统的电化学发光物质有鲁米诺、联吡啶钌、芳香烃类等。进入21世纪后,在此基础上,为了提高传统的发光物质的电子发光效率,引入了量子点、半导体材料,关于ECL的各种研究日新月异。1996年,科研工作者首次提出"分子信标"这一概念。因分子信标呈独特的发夹结构,所以有良好的稳定性,又因碱基互补配对原则,有良好的特异性。分子信标主要分为荧光分子信标和电化学分子信标。荧光分子信标在茎部的两端标记荧光基团和猝灭基团,当没有目标时,荧光基团和猝灭基团距离非常近,发生能量共振转移,荧光被猝灭;当有目标时,目标与信标形成双链杂交体,荧光基团和猝灭基团的距离拉开,荧光基团恢复荧光,产生信号。由于分子信标具有设计灵活多变、合成简单、特异性识别能力强等优点,已经在生物大分子检测领域取得广泛应用。我们实验组在前面探究的基础上,结合电化学发光技术和分子信标技术研制出了新型的电化学发光催化活性开关信标(ECL-MB),结合核酸适配体技术,再结合EXO Ⅲ和DNAzyme酶信号扩增技术,构建了一种基于EXO Ⅲ和DNAzyme酶信号扩增的高灵敏电化学发光生物传感器。应用该生物传感器检测凝血酶和UDG酶,本方案操作简单快速、检测灵敏度高,ECL-MB在复杂环境中仍能保持良好的生物活性与稳定性,有望在活体检测中取得更广泛的应用,在生物检测方面有良好的前景。该方法在电化学发光技术和分子信标技术的各自领域取得了进一步发展,也对两种技术的结合提供了新的思路。第一章绪论在本章,我们首先介绍了电化学发光的基本原理以及它的相关背景,传统的电化学发光物质和当今各种新技术的结合使ECL技术在各个领域有了更广泛的应用。然后介绍了分子信标的基本知识和研究进展,分子信标技术在各个领域的应用。最后介绍了我们实验室研制的新型电化学发光催化活性开关信标(ECL-MB)及其工作机理。第二章基于8-17 DNAzyme信号扩增构建高灵敏电化学发光生物传感器用于检测凝血酶在本章,基于8-17DNAzyme酶信号扩增技术结合核酸适配体技术,我们构建了一种高灵敏电化学发光生物传感器用于凝血酶的检测。合成的电化学发光催化活性开关信标(ECL-MB)的茎部两端均标记具有催化活性的卟啉铁(hemin)。在无目标时,ECL-MB以发夹结构存在,hemin以稳定的二聚体形式存在,ECL-MB的催化活性开关关闭,无法催化鲁米诺发生电化学发光反应,ECL信号很低。当存在凝血酶时,凝血酶与probe作用,释放出8-17DNAzyme链,8-17DNAzyme继续与ECL-MB反应,在Zn2+的催化下,ECL-MB断裂,hemin恢复单体形态,催化鲁米诺发生电化学发光反应,ECL信号剧增。实验结果表明,该方法可以简单快速,高灵敏的检测凝血酶,在10pM-lnM之间,ECL信号与凝血酶浓度之间呈良好的线性关系。第三章基于EXOⅢ剪切信号放大构建高灵敏电化学发光生物传感器用于检测UDG酶在本章,我们设计了一种基于Exonuclease Ⅲ酶剪切信号放大的电化学发光生物传感器用于检测UDG酶的活性。该方案中,我们首先设计了一条ds-DNA,命名为probe1,由S1和S2链构成,S2链中含有U碱基,在目标物UDG酶的剪切下,probe1的双链结构遭到破坏,释放出S1链。S1链再与probe2(S3/S4)作用,在Exonuclease Ⅲ酶的作用下,形成两个循环,释放出S3链。S3链再与ECL-MB作用,形成ECL-MB/S3杂交体,ECL-MB由发夹结构变为双链结构,hemin二聚体形式遭到破坏,恢复成hemin单体形态,电化学发光催化活性恢复,催化鲁米诺-H202体系,产生强烈的ECL信号。该电化学发光生物传感器应用于对UDG酶的检测,表现出了极高的灵敏度和选择性,最低检出限可达到1.3×10-5U/mL。该方法能特异性检测识别UDG酶,即使是在UDG酶浓度很低的环境中,亦表现出了良好的抗干扰性。同时应用本方法检测了 Hela细胞,MCF-7细胞中的UDG酶,在实际生物样品检测中取得进一步发展。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O657.3

【参考文献】