禽畜粪便堆肥过程中耐药基因变化的研究

发布时间：2017-12-31 04:22

  本文关键词：禽畜粪便堆肥过程中耐药基因变化的研究　出处：《华东师范大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 四环素耐药基因 ARGs ARBs 禽畜粪便 堆肥 16SrDNA PCR 定量PCR

【摘要】：抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,简写为ARGs)是新兴的环境污染物。在禽畜养殖过程由于频繁使用抗生素类药物,导致禽畜肠道中生成大量耐药菌(Antibiotic resistant bacteria,简写为ARBs),这些耐药菌群携带大量抗性基因,它们会通过粪便进入环境中。目前,禽畜粪便处理最常用的工艺是堆肥,禽畜粪便经过高温堆肥处理后可有效减小体积,杀死有害细菌。本研究采用现代分子生物技术:定性PCR、荧光定量PCR和16SrDNA高通量测序技术综合分析了采集于上海市茹塘养猪场和太平洋禽蛋养鸡场的新鲜粪便中四环素类抗性基因在堆肥过程中的变化和堆肥过程中优势菌群、耐药菌群的变化及其与耐药基因关系的探讨,并得出以下研究结论:(1)猪粪样品中tet-R基因(除tet(D)未检测到)均检测到,说明tet-R基因在猪粪中普遍存在。这些tet-R基因在猪粪堆肥中的检出率大小排序为tet(A)=tet(O)=tet(M)tet(X)tet(G)tet(B)=tet(C)tet(S)tet(E)。堆肥结束,tet(B)、tet(C)、tet(E)、tet(G)、tet(S)未检测到,但是 tet(A)、tet(M)、tet(O)、tet(X)依然存在。在鸡粪堆肥样品中发现tet-R基因(除tet(D)、tet(B)、tet(E)未检测到)在样品中均检测到,说明tet-R基因在鸡粪中也普遍存在。这些tet-R基因检出率大小排序为tet(A)=tet(O)=tet(M)tet(X)=tet(S)tet(G)=tet(C)。堆肥结束,只有tet(C)在腐熟的鸡粪堆肥中未检测到,但是tet(A)、tet(S)、tet(G)、tet(M)、tet(O)、tet(X)依然存在。研究结果表明大部分tet-R基因在堆肥结束后依然存在,但有少部分的tet-R基因被完全去除,所以堆肥对于耐药基因的消除有一定的作用。(2)猪粪堆肥腐熟后tet(A)和tet(C)基因的含量相比于新鲜猪粪均有降低,且随着堆肥的进行tet(A)和tet(C)的含量呈下降趋势,去除效率分别为49%和99.9%,堆肥处理对tet(C)的去除效果更好。相关性分析发现猪粪堆肥中tet(A)含量与C/N的变化呈显著相关(P0.05),与pH变化呈负相关(P0.05),C/N和pH很可能是影响猪粪堆肥过程中tet(A)抗性基因消减的重要因素。鸡粪堆肥中tet(A)和tet(C)基因的含量相比于新鲜鸡粪也均有降低,且随着堆肥的进行tet(A)和tet(C)的含量呈先上升后下降趋势,去除率分别为98.8%和69.6%,鸡粪堆肥的处理对tet(A)的去除效果更好,这与猪粪堆肥的处理结果不同,相关性分析表明鸡粪堆肥中tet(C)丰度的变化与C/N的变化成正相关性(P0.05),说明C/N可能是影响鸡粪堆肥过程中tet(C)丰度变化的重要因素。研究结果显示两组堆肥处理对tetA和tetC均有消减作用,据此推测堆肥过程可能有利于tet-R基因含量的降低。(3)高通量测序结果表明厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidet es)、放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)四大菌群均是猪粪和鸡粪堆肥全过程中的优势菌群,且大部分的耐药菌属于这四大门类。猪粪与鸡粪经过高温堆肥后群落结构变化均较大,研究发现猪粪与鸡粪中与耐药基因相关的菌群主要包括Bacterpodes 属、Enterobacteriaceae科、Pseudomonadaceae科、Ruminococcus 属、Clostridium 属、Parabacteroides 属、Prevotellaceae 科、Pseud omonas属、Corynebacterium属、Ruminococcaceae科,这些菌群经过高温堆肥后均呈现下降趋势,且部分菌群相对丰度下降显著。Thermomonosporaceae、Str eptosporangiaceae、Micromonosporaceae、Bacillaceae、Halanaerobiaceae、OP B54_norank、Paenibacillaceae、Alcaligenaceae、Methylococcaceae、Oceanospir illales_unclassified、Saprospiraceae、Clostridia__unclassified、Firmicutes unclassif ied、Bacilli_unclassified和S0134_terrestrial_group 在新鲜猪粪和新鲜鸡粪中的丰度较低,甚至部分菌群不存在新鲜猪粪和鸡粪中,经过堆肥处理后这些菌群丰度显著升高,成为腐熟的猪粪和鸡粪中的高丰度菌群。
[Abstract]:Antibiotic resistance genes (antibiotic resistance genes, abbreviated as ARGs) is an emerging environmental pollutants. In livestock breeding process due to the frequent use of antibiotics, lead to a large number of drug-resistant bacteria in the intestinal tract of livestock (Antibiotic resistant bacteria, abbreviated as ARBs), the drug-resistance bacteria carrying a large number of resistance genes, they will pass the feces into the environment. At present, livestock manure treatment process is the most commonly used compost, manure after composting at high temperature can effectively reduce the volume, to kill harmful bacteria. In this study, using modern molecular biological techniques: qualitative PCR, quantitative PCR and 16SrDNA high-throughput sequencing technology was analyzed in the acquisition of tetracycline resistance genes in Shanghai pig and Ru Tang Pacific egg farm fresh feces advantage process changes during the composting and composting of bacteria, bacteria and drug resistance change 涓庤，

本文编号：1358101