麦麸酯酶的制备及其酶学性质的研究

发布时间：2020-07-19 04:33

【摘要】：酯酶是能够使酯键分解,生成酸和醇一系列酶的总称。植物酯酶是植物不同部位、各个成长时期的细胞组成成分,是羧酸酯水解酶类一种。植物酯酶能够使α-乙酸萘酯水解生成乙酸和α-萘酚,显色剂与α-萘酚反应生成紫色络合物。氮基甲酸酯类农药和有机磷类农药会抑制植物酯酶酶活力,因此通过植物酯酶酶活力的抑制程度判断农药的残留量。本研究以麦麸为植物酯酶的提取原料,对麦麸酯酶的分离及纯化技术进行了研究,并对纯化后的麦麸酯酶进行酶学性质研究。主要研究结果如下：1.选择底物为a-乙酸萘酯,显色剂为固兰B盐,考察吸收波长、缓冲液pH、温度、SDS浓度、底物浓度、显色剂浓度及用量对麦麸酯酶单位酶活(U/mL)的影响,采用响应面实验确定的麦麸酯酶的最佳酶活力测定条件为：缓冲液pH值7.2、底物a-乙酸萘酯浓度8×10-44mol/L、恒温水浴温度40℃,SDS浓度4.25%；单位酶活力达16194.35U/mL。验证实验结果与模型值相符,证明应用响应面法所得到的麦麸酯酶酶活力测定工艺参数是可行的。2.以NaNO3-磷酸缓冲液为溶剂对麦麸酯酶进行水浴静置提取,分析提取液pH值、外加无机盐种类及浓度、料液比、时间及温度等提取因素对麦麸酯酶单位酶活的影响。利用Box-Behnken试验,进一步研究了NaNO3浓度、提取时间、提取温度3个因素及交互作用对麦麸酯酶单位酶活(U/mL)的影响,确定麦麸酯酶的最佳提取工艺参数为：NaNO3浓度0.15mo1/L、提取温度35℃、提取时间60min,此条件下单位酶活的预测值为23338.0U/mL,验证值为23018.7U/mL达到预测值的98.63%。3.采用PEG/(NH4)2SO4双水相体系萃取麦麸酯酶粗酶液,通过考察不同聚乙二醇分子量、聚乙二醇浓度、无机盐种类、无机盐浓度、体系pH和外加无机盐离子强度对麦麸酯酶总蛋白分配系数、酶活回收率、纯化倍数的影响,并通过响应面分析法优化了萃取条件。结果表明最佳萃取条件为：PEG1000质量浓度为21%、(NH4)2SO4质量浓度为]8%、pH4.4。回归方程预测双水相萃取纯化倍数可达到2.9208,三次验证实验的平均纯化倍数为2.9190,达到预测值的99.93%。4.麦麸酯酶经硫酸铵分段沉淀、透析及SephadexG-200凝胶层析,收集酶液超滤浓缩,采用考马斯亮蓝G-250法测蛋白含量,酶的比活力为289.14 U/mg.回收率为47.7%,纯化倍数为16.17。经SDS-PAGE电泳,利用蛋白分析软件计算出麦麸酯酶的分子量约为26.0KDa。5.对纯化后的麦麸酯酶进行了基本酶学性质分析,结果表明：最大紫外吸收峰为224nm和280nm,最适反应温度为30℃,温度稳定范围为25-40℃,最适pH为8.0,pH稳定范围在4.0-8.0,Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+柠檬酸钠、四硼酸钠均对麦麸酯酶有抑制作用,而Fe2+、Mn2+、柠檬酸、硫酸铝钾对该酶有激活作用；麦麸酯酶以α-乙酸萘酯为底物的动力学参数,Km和Vmax值分别为0.85mg·ml-1和0.93mg·mL-1·min-1。4℃时,麦麸酯酶半衰期为10.4天,而25℃时,酯酶半衰期为8.6天。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS201.25

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