cAMP-PKA信号途径调控梨果皮蜡质物化信号诱导Alternaria alternata侵染结构分化的分子机制

发布时间：2020-11-03 02:19

　　 果实表皮角质层在病原物与寄主互作中具有双重作用,一方面作为病原物侵染的物理屏障,另一方表皮的物理化学信号对病原物,尤其对亲和性菌株的侵染具有诱导作用,但其调控机理尚需进一步揭示。本研究以梨果黑斑病菌A.alternata为研究对象,先通过药理学方法研究cAMP特异性抑制剂阿托品对梨果皮蜡质提取物诱导的A.alternata生长、侵染结构及致病性的影响;进一步对梨果致病真菌A.alternata基因PKAc和PKAr进行克隆和生物信息学分析的基础上,构建ΔAaPKAc和ΔAaPKAr突变株,从分子水平上系统研究了PKAc和PKAr基因对A.alternata生长、胁迫响应、梨果皮蜡质诱导侵染结构的形成和致病性的影响。结果如下:1.cAMP信号级联通路抑制剂阿托品处理后显著抑制了表皮疏水性和蜡质介导的A.alternata的孢子萌发和附着胞形成。其中抑制剂处理后4 h,A.alternata在高疏水性和果蜡涂膜表面附着胞形成率分别较对照降低了75.3%和63.7%。外源cAMP的处理可部分恢复其抑制剂的作用,外源cAMP+阿托品处理后4 h,在高疏水性和果蜡涂膜表面,A.alternata附着胞形成率为抑制剂阿托品单独处理的2.4倍和1.6倍。2.通过NCBI blast分析和基因克隆,从A.alternata基因组中鉴定出cAMP依赖性蛋白激酶PKA的催化亚基和调节亚基,命名为PKAc和PKAr。梨黑斑病菌A.alternata的PKAc和PKAr基因的ORF全长分别为1571 bp和1737 bp,分别编码488和461个氨基酸。各功能结构域和其它真菌PKA激酶催化亚基和调节亚基的同源性较高,PKAc和PKAr均含有其保守RXSY和RRXS结构域。PKAc基因在梨果蜡质涂膜表面诱导A.alternata附着胞形成过程中的表达量显著高于单独疏水膜,而PKAr基因在疏水膜诱导孢子萌发过程中表达量显著上调。3.采用同源重组策略和农杆菌转化法对A.alternata的PKA激酶催化亚基PKAc和调节亚基PKAr进行敲除,获得具有潮霉素抗性的转化子,经过DNA水平和RNA水平的双重鉴定,最终得到了ΔAaPKAc和ΔAaPKAr突变株。与A.alternata野生型菌株相比,ΔAaPKAc菌落生长缓慢,生物量减少、产孢量增加,而ΔAaPKAr丧失了分生孢子形成能力。ΔAaPKAc和ΔAaPKAr突变株胞内cAMP含量升高、PKA含量降低。ΔAaPKAc突变株对氧化胁迫和渗透胁迫的耐受性增加,对细胞壁合成抑制剂的敏感性增强,相反,ΔAaPKAr突变株较野生型对氧化胁迫和渗透胁迫更敏感。此外,ΔAaPKAc与野生型菌株相比在损伤接种的梨果上扩展能力降低,且与野生型相比ΔAaPKAc突变株黑色素增加,毒素TEN、ALT、AME和AOH的含量降低,同时也降低了胞外降解酶Cx和β-葡聚糖酶活性。4.高疏水性和梨果蜡提取物涂膜表面显著促进了A.alternata的孢子萌发和附着胞形成,ΔAaPKAc相比于野生型菌株显著降低了表皮疏水性和蜡质介导孢子萌发和附着胞形成,其中对附着胞形成的抑制效果更加显著,当培养4h后,在高疏水性(108°)和果蜡涂膜表面ΔAaPKAc相比于野生型菌株附着胞形成率分别降低了31.6%和38.3%。洋葱表皮脱蜡再涂果蜡表面可以显著促进A.alternata附着胞和侵染菌丝的形成。综上所述,cAMP-PKA信号通路在梨黑斑病菌A.alternata的生长、致病性和生物胁迫中发挥着重要的作用,且cAMP-PKA信号通路参与了梨果表皮物化信号介导的A.alternata侵染结构的调控。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：TS255.1
【部分图文】：

芍本?cm的圆形，灭菌后铺在IM固体培养基平板(含200μMAS)上。取上述预培养后的农杆菌和A.alternata孢子各100μL混匀，均匀涂布于玻璃纸上，晾干后于28°C恒温培养箱中避光共培养44h。然后，将玻璃纸揭下转移到PDA固体培养基平板(含潮霉素250μg/mL，羧苄青霉素钠500μg/mL)上，在28°C恒温培养箱中培养2-3d，至转化子出现后，挑取转化子到新的PDA固体培养基平板(含潮霉素250μg/mL，羧苄青霉素钠500μg/mL)上。将转化子在含抗生素和不含抗生素的平板上传代接种3次，以确保抗性遗传稳定性。2.6.3敲除突变株的筛选及鉴定图2阳性转化子验证方法和引物位置示意图Fig.2Schematicofthemethodoftransformantsscreeningandthelocationsoftheprimersused通过对比野生型菌株与突变株，野生型菌株应该没有HPH片段，突变株包含HPH片段。野生型菌株有目的基因片段，而突变株里没有目的基因片段。用引物PKAc-up-F和PKAc-down-R验证，突变株的全长总共为4.4kb，而野生型菌株的全长为3.5kb，用引物PKAr-up-F和PKAr-down-R验证，突变株的全长总共为4.4kb，而野生型菌株的全长为3.7kb。野生型菌株上游并没有定点插入的Olic片段，而突变株上游应该有

cAMP-PKA信号途径调控梨果皮蜡质物化信号诱导Alternariaalternata侵染结构分化的分子机制28图3cAMP在疏水性诱导A.alternata对孢子萌发率(A)和附着胞形成率(B)的影响.大写字母表示不同接触角间差异，小写字母表示同一接触角不同处理间差异(P＜0.05).Fig.3EffectsofcAMPonsporegerminationrate(A)andappressoriumformationrate(B)ofAlternariaalternatainducedondifferenthydrophobicsurface.Theverticallineindicatingstandarderror(±SE);uppercaselettersindicatingdifferencesbetweendifferentcontactangles;lowercaselettersindicatingthesamedifferenceincontactanglebetweentreatments(P<0.05).3.1.2cAMP抑制剂阿托品对蜡质诱导A.alternata侵染结构形成的影响分别以蜂蜡（B）和石蜡（P）为对照，研究A.alternata对同一疏水表面（接触角101°）不同蜡质表面的响应，结果表明梨果蜡（F）对A.alternata孢子萌发率（图4A）和附着胞形成率（图4B）的诱导作用比石蜡和蜂蜡强，尤其显著地刺激了附着胞的形成。在培养4h后，A.alternata在果蜡表面附着胞形成率较石蜡和蜂蜡提高了36.3%和64.7%。cAMP抑制剂atropine处理显著降低了果蜡、石蜡和蜂蜡诱导A.alternata的孢子萌发率（图4A）和附着胞形成率（图4B），对附着胞形成率的抑制作用更明显，其中培养4h在果蜡表面抑制剂atropine与对照相比附着胞形成率显著降低了63.7%（p＜0.05）。当加入外源性dibutyryl-cAMP后，可以部分恢复A.alternata的孢子萌发率和附着胞形成率，其中对附着胞的恢复作用更强，在培养4h时，果蜡表面外源性dibutyryl-cAMP与抑制剂atropine单独处理相比，果蜡表面A.alternata附着胞形成率恢复了1.6倍。

甘肃农业大学2020届硕士学位论文29图4cAMP在蜡质诱导A.alternata对孢子萌发率(A)和附着胞形成率(B)的影响.竖线表示标准误(±SE).大写字母表示不同蜡质间差异，小写字母表示同一蜡质不同处理间差异(P＜0.05).Fig.4EffectofcAMPonwax-inducedsporegerminationrate(A)andappressoriumformationrate(B)ofAlernariaalternata.Verticallineindicatingstandarderror(±SE);uppercaselettersindicatingdifferentwaxydifferences;lowercaselettersindicatingthesamedifferenceinwaxytreatment(P<0.05).3.1.3cAMP抑制剂阿托品对A.alternata菌落生长的影响使用cAMP抑制剂atropine和外源性dibutyryl-cAMP处理链格孢培养基，在1、3、5、7d时观察其菌落直径，发现atropine处理与对照组相比，A.alternata的菌落直径没有变化差异（图5）。此外，加入外源性dibutyryl-cAMP与对照组相比，A.alternata的菌落直径也没有明显变化。
【参考文献】

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本文编号：2867951