甘南传统牦牛酸奶中抗氧化菌株分离、诱变及筛选

发布时间：2020-11-04 23:09

　　 高原牧区牦牛奶资源丰富,牧民世代沿用传统而古老的自然发酵方法制作酸奶,牦牛发酵乳中蕴含着遗传稳定性好、抗逆性强、发酵性能优良的乳酸菌。虽然国内学者在乳酸菌的筛选等方面做了大量的研究,但目前可以投入商业化应用的乳酸菌仍然较少。甘南独特的生态环境孕育了丰富多样的微生物资源,发酵及抗氧化能力强的乳酸菌是提升食品品质的关键。以甘南牧区传统自然发酵的牦牛酸乳为试材,在对所筛选的优势菌株发酵性能测定的基础上,对其抗氧化性能进行了对比分析。并对优势菌株开展了重离子加速诱变,研究了诱变菌株对发酵乳感官、理化及氧化性能的影响,旨在从我国传统发酵乳制品中筛选出发酵性能和抗氧化性能优良的乳酸菌。研究结果如下:1.乳酸菌分离鉴定及特性。甘南传统牦牛酸奶样品中共分离出了46株菌株,经耐受过氧化氢、耐酸、耐胆盐、凝乳性能测定,筛选出了6株优势菌株,在通过抗氧化活性筛选出1株菌株;糖发酵试验及16S rDNA鉴定证明M5为副干酪乳杆菌(L.paracasei)。M5对DPPH、?OH、O_2~-·清除率在菌体浓度为1×10~9CFU/mL的无细胞提取物下分别为48.4%、4.76%、49.9%;酵母存活细胞模型验证M5菌株的无细胞提取物、发酵上清液、完整细胞对酿酒酵母的存活率分别提高了95.3%、130%和28.5%。2.M5菌株重离子束诱变筛选。采用0-360 Gy剂量重离子束辐照M5菌悬液,研究结果表明,辐照剂量360 Gy致死率高达90.13%;100-140Gy剂量正突变率为26.9%-21.3%显著高于负突变率14.3%-11.8%,100Gy剂量下有助菌株正向突变。经碳酸钙平板筛选、24孔深孔板和摇瓶发酵复筛,筛选出了在20 Gy剂量下,发酵及抗氧化强的突变株N1。N1液体培养发酵26h产酸能力为14.4g/L,较出发菌株M5提高了42.15%;无细胞提取物总抗氧化性、羟自由基抑制力和金属Fe~(2+)的螯合力分别为0.166mM FeSO_4、49.19 U/mL、3.06%,较M5提高了23.8%、34%和402%。9代斜面传代培养,突变株N1遗传稳定性良好。3.诱变菌株特性。生长曲线N1和M5菌株差异不显著,24h培养OD_(600)吸光度为1.8-1.9。菌株N1在pH3.0和0.3%牛胆盐存活率为58.9%和45.7%,较M5提高了10.5%和4.58%,自凝聚力提高了20.1%。耐受胃液力及菌株表面疏水性菌株N1与M5无明显差异,基本形态均有所改变,N1较M5耐受肠液能力下降了4.29%。4.发酵乳特性。在同等发酵条件下,N1与M5发酵乳在7d时感官无明显差异,但营养成分评价中,N1发酵乳具有较高的第一限制性氨基酸评分。发酵乳DPPH·清除活性分别为92.31%与89.96%,60min亚铁离子的螯合力分别为76.15%与67.11%,清除H_2O_2活性分别为25.01%与11.85%,抗氧化优于M5菌株。上述研究表明,甘南传统酸奶所筛选的副干酪乳杆菌M5,经重离子束诱变所获得的优势菌株N1,其产酸能力、抗氧化能力均有所提升,发酵乳具有良好的益生性能,具有生产发酵菌剂的潜质。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2020
【中图分类】：TS252.54
【部分图文】：

甘肃农业大学2020届硕士学位论文耐受胆盐的能力是益生菌株的在肠道环境中存活的必备条件。菌株的生长受胆酸盐的影响十分巨大，不同菌株的胆盐耐受性差异明显，大部分菌株耐胆盐效果较好，存活率在30%以上，则表明其具有较高的耐受活性。3.2抗氧化菌株筛选3.2.1DPPH自由基清除率因DPPH有单电子，当有抗氧化物质存在时是就会清除DPPH的单电子，增加DPPH的稳定性，溶液也随之将颜色从紫色变为黄色，在517nm处具有吸光度，可用分光光度计来检测溶液的褪色情况，进而测定DPPH的清除能力[81]。图3-1各菌株对DPPH自由基的清除效果Fig.3-1DPPHradical-scavengingabilityof6screenedstrains注：图中不同字母（a-e）表示不同菌株相同处理下差异显著（p〈0.05）,下同如图3-1所示，6株乳酸菌的CFS、IC和CFE处理组均表现出了的DPPH自由基清除能力，但不同菌株对DPPH自由基清除能力表现不同。CFS和CFE组中较强清除能力的为M5，IC组中清除能力较强的为T4和M11。总体来看，菌株M5的DPPH自由基清除能力最强，其中CFS处理组中清除率高达47.8%，显著高于其他菌株的CFS处理组，其IC组合CFE组的清除率分别为42.7%和48.4%。该菌株的清除自由基的活性物质大部分是代谢分泌物与完整细胞，胞内物质也存在少量的抗氧化活性物质，这与郭慧芬等[82]学者研究基本一致。有报道显示，乳酸菌具有DPPH自由基清除活性可能和菌体产生的胞外多糖有关，Xu等[83]的研究显示DPPH自由基的清除活性与由双歧杆菌分离出的胞外多糖的浓度呈正相关。

甘南传统牦牛酸奶中抗氧化菌株分离、诱变及筛选213.2.2OH自由基清除率羟自由基是一种存活时间短但却具有很强氧化性的自由基。它可以与氧化剂产生反应生成红色物质。在532nm处具有强烈的吸光度，可以用分光光度计来检测溶液的褪色情况判定抗氧化能力强弱[84]。图3-2各菌株OH清除率测定结果Fig.3-2Hydroxylradical-scavengingabilityof6screenedstrains由图3-2可知，M5的CFS组对OH的清除率为54.4%，显著高于其它组；CFE组中M8的清除能力较高，为29.3%；IC组中M5、M8和Mx表现出较高的清除能力，分别为36.9%、34.4%和33.5%。相同菌株的OH自由基清除能力中CFS处理组高于IC和CFE处理组，说明这几株乳酸菌清除羟自由基的活性物质主要存在菌体表面以及代谢产物中而非胞内，不同乳酸菌的羟自由基清除能力因其活性物质的种类和含量不同而存在定差异，这与李默等[85]研究具有相似性。3.2.3超氧阴离子（O2－·）清除率邻苯三酚自氧化，作为供电子体在325nm处具有吸光度[86]。从图3-3中可以看出菌株CFE组表现极高的清除能力为M5；IC处理组中清除能力较强的为G4；CFS处理组中表现较好的菌株为M5。不同菌株对超氧阴离子的清除能力表现出较大的差异性能，菌株M5的CFE清除率最高为49.9%；菌株CFS处理组的清除O2-的能力低于相同菌株的CFE处理组。试验结果可以发现，乳酸菌清除O2－·的活性物质大部分存在于胞内。菌株M5CFE的清除率高于陈明[87]筛选LparacaseiBX62CFE为31.98%的清除活性。

甘肃农业大学2020届硕士学位论文图3-3各菌株对O2－清除效果Fig.3-3Superoxideanionradical-scavengingabilityof6screenedstrains乳酸菌菌体及无细胞提取物具有超氧阴离子自由基清除能力可能是由于其菌体细胞及代谢产物中存在各种各样的氧化酶。有报道显示，乳酸菌存在不同的活性氧族（reactiveoxygenspecies，ROS）解毒机制，包括过氧化氢酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）和各种各样的氧化酶。以菌株的抗氧化能力为主，结合菌株的耐酸性以及高耐胆盐和凝乳发酵性能，从46株中最终挑选出具有良好的表现能力的M5菌株，对菌株M5进行酵母细胞验证试验。3.3酵母存活细胞模型Fontana等[88]学者研究发现酵母细胞的衰老代谢机制与人体细胞衰老机制相似。Burtner[89]认为在研究氧化应激损伤中酿酒酵母是理想的生物模型，具有简单而独特的生长代谢规律。由图3-4可知，在加入乳酸菌的发酵上清液、完整细胞组和无细胞提取物后，经H2O2处理的酵母细胞的增长率都有所提高，增长率分别为130%、28.5%和95.3%，其中菌株M5的发酵上清液与无细胞提取物的氧化应激保护作用更加明显。图3-4酿酒酵母细胞增长Fig.3-4Saccharomycescerevisiaecellgrowth
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本文编号：2870747