四川黑茶渥堆过程中纤维素酶、果胶酶分泌菌株的筛选及其产酶条件优化

发布时间：2020-11-16 12:49

　　 四川黑茶具有独特的地域性和政治特征,其品质高低直接影响边疆少数民族同胞的身体健康、边疆稳定和民族团结。渥堆作为四川黑茶品质形成的关键工序,其湿热环境有利于微生物的生长、繁殖,渥堆微生物所分泌的纤维素酶、果胶酶等水解酶类对四川黑茶品质的转化及形成功不可没。研究者对黑茶渥堆过程的微生物进行了大量研究,但对四川黑茶渥堆微生物所分泌的纤维素酶、果胶酶及其相关性质的研究却未见报道。因此,明确四川黑茶渥堆微生物中分泌纤维素酶、果胶酶的主要微生物种类,研究其纤维素酶特性,深入分析其在四川黑茶品质形成中的具体作用,对于扩大食品等行业纤维素酶、果胶酶微生物来源及其进一步应用,缩短四川黑茶生产周期,提高其品质具有重要意义。此外,进一步探索和优化微生物纤维素酶产酶条件,对于提高微生物纤维素酶活性具有重要的实践意义。本研究拟采用分子生物学、生物信息学手段,微生物平板技术及常用手段相结合的方式,筛选四川黑茶渥堆微生物中纤维素酶、果胶酶分泌菌株,并对其酶学特性进行研究,对纤维素酶分泌菌株的产酶条件进行探索和优化。此外,采用液态发酵的方式分析纤维素酶、果胶酶分泌菌株对液态茶品质成分的影响。主要研究结果如下：(1)从四川黑茶渥堆微生物中共筛得分解纤维素效果较好的菌株18株,其中,酵母菌1株,霉菌6株,放线菌7株,细菌4株,其分解纤维素能力大小依次为：放线菌细菌酵母菌霉菌。摇瓶发酵复筛实验发现,放线菌分泌纤维素酶活性整体高于细菌和真菌,综合初筛、复筛结果,选择SDT18、SDT53、SDT95号菌株为分泌纤维素酶的高产菌株。分子生物学分析结果分别将SDT18、SDT95、 SDT53号菌株初步鉴定为Aspergillus niger strain FCBP648(黑曲霉)、Bacillus subtilis strain ZZ120(枯草芽孢杆菌)、Streptomyces diastaticus subsp.ardesiacus strain HDJZ-zwm-45(淀粉酶链霉菌亚种)。摇瓶培养期间,SDT95号菌株其菌株生物量随培养时间的延长呈现逐渐增加的趋势,而其CMCase和FPA酶活性并未出现大幅度的变化；使SDT95号菌株的CMCase酶活达到最大时的酶反应pH为5,使其CMCase酶活较高的酶反应温度依次为45℃55℃40℃50℃。(2)在液体培养基组分及浓度优化的单因素实验基础上,采用二次通用旋转组合设计实验对培养基组分及浓度进行优化,得出利于纤维素酶分泌菌株SDT95产CMCase的液体培养基组分配比为：葡萄糖1.68%,牛肉膏0.82%,氯化钠0.32%,磷酸氢二钾0.22%,利于菌株产FPA的液体培养基组分配比为：葡萄糖1.63%,牛肉膏0.86%,氯化钠0.37%,磷酸氢二钾0.16%。在摇床培养条件优化的单因素实验基础上,利用二次通用旋转组合设计实验对摇床培养条件进行优化,得出利于SDT95菌株CMCase酶活提高的摇床培养条件为：菌株接种量2m1,发酵培养时间6d,摇床培养温度29℃。实验所考察的3个因素对FPA酶活的影响均较小,FPA酶活可能还受到其它未被考虑进实验方案的因素所影响。(3)从四川黑茶渥堆微生物中初筛得到分泌果胶酶效果较明显的菌株共19株,其中,酵母菌1株,霉菌6株,放线菌9株,细菌3株。摇瓶发酵复筛实验测得各类群微生物分泌果胶酶活性依次为放线菌细菌霉菌酵母菌。结合初筛、复筛结果选得SDT22、SDT60、SDT87号菌株为分泌果胶酶的高产菌株。分子生物学分析结果分别将SDT22、SDT87、SDT60号菌株初步鉴定为Penicillium commune strain G20-23(普通青霉)、Streptomyces thermoviolaceus(热紫链霉菌)、Streptomyces pactum strain 173612(密旋链霉菌)。(4)筛得的分泌纤维素酶、果胶酶效果较好的菌株在以纯茶汤为培养基的单菌液体发酵实验中均能造成茶汤中茶多酚含量的降低；除SDT93号菌株外,均能造成茶汤中茶黄素含量的增加；供试菌株对茶汤茶红素、茶褐素含量的影响相对比较复杂；除SDT4、87、93号菌株外,所有试验菌株相较空白对照均能使茶汤中氨基酸含量得到提高；与空白对照相比,SDT52、53、59、60、87、93、95、102号菌株分别使茶汤中可溶性糖含量增加,而SDT4、10、13、18、22、29、40、64号菌株则分别使茶汤中可溶性糖含量降低；除SDT93号菌株外,试验茶汤中水溶性果胶含量相较空白对照均出现增加的情况。
【学位单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：TQ925
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩写词（ABBREVIATION）
第一章 绪论
    1 黑茶中主要微生物种群
        1.1 云南普洱茶中的主要微生物种群
        1.2 湖南茯砖茶中的主要微生物种群
        1.3 四川黑茶中的主要微生物种群
        1.4 广西六堡茶及湖北青砖中的主要微生物种群
    2 微生物与黑茶品质形成
        2.1 微生物与普洱茶品质形成
        2.2 微生物与湖南茯砖茶品质形成
        2.3 微生物与四川黑茶品质形成
    3 微生物促进黑茶品质形成的主要途径
        3.1 微生物胞外酶与黑茶品质形成
        3.2 微生物热与黑茶品质形成
    4 纤维素酶、果胶酶的微生物来源及其分泌菌株的筛选
        4.1 纤维素酶的微生物来源及其分泌菌株的筛选
            4.1.1 纤维素酶的微生物来源
            4.1.2 纤维素酶分泌菌株的筛选方法
        4.2 果胶酶的微生物来源及其分泌菌株的筛选
            4.2.1 果胶酶的微生物来源
            4.2.2 果胶酶分泌菌株的筛选方法
    5 本研究的目的与意义
第二章 四川黑茶渥堆过程中纤维素酶分泌菌株筛选及其酶学特性初步研究
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 主要仪器设备
        1.3 试验方法
            1.3.1 纤维素酶分泌菌株的筛选
            1.3.2 纤维素酶高产菌株的鉴定
            1.3.3 纤维素酶酶学特性初步研究
            1.3.4 数据处理
    2 结果与分析
        2.1 四川黑茶渥堆过程中纤维素酶分泌菌株的筛选
            2.1.1 纤维素酶分泌菌株初筛
            2.1.2 纤维素酶分泌菌株复筛
        2.2 纤维素酶高产菌株的鉴定
            2.2.1 纤维素酶高产菌株的分子鉴定
            2.2.2 纤维素酶高产菌株的形态学及理化特性分析
        2.3 纤维素酶酶学特性初步研究
            2.3.1 菌株生长特性
            2.3.2 酶反应pH、温度对纤维素酶活性的影响
    3 讨论与小结
        3.1 讨论
        3.2 小结
第三章 纤维素酶高产菌株产酶条件优化
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 主要仪器设备
        1.3 试验方法
            1.3.1 液体培养基组分及浓度的优化
            1.3.2 摇瓶培养条件的优化
            1.3.3 数据处理
    2 结果与分析
        2.1 液体培养基组分及浓度的优化
            2.1.1 单因素实验
            2.1.2 二次通用旋转组合设计实验
        2.2 摇床培养条件的优化
            2.2.1 单因素实验
            2.2.2 二次通用旋转组合设计实验
    3 讨论与小结
第四章 四川黑茶渥堆过程中果胶酶分泌菌株筛选及初步鉴定
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 主要仪器设备
        1.3 试验方法
            1.3.1 果胶酶分泌菌株的筛选
            1.3.2 果胶酶高产菌株的鉴定
            1.3.3 数据处理
    2 结果与分析
        2.1 四川黑茶渥堆过程中果胶酶分泌菌株的筛选
            2.1.1 果胶酶分泌菌株初筛
            2.1.2 果胶酶分泌菌株复筛
        2.2 果胶酶高产菌株的鉴定
            2.2.1 果胶酶高产菌株的分子鉴定
            2.2.2 果胶酶高产菌株的形态学及理化特性分析
    3 讨论与小结
第五章 纤维素酶、果胶酶分泌菌株对四川黑茶品质影响的研究
    1 材料与方法
        1.1 材料与试剂
        1.2 主要仪器设备
        1.3 试验方法
            1.3.1 纯茶汤培养基的制备
            1.3.2 菌株接种发酵
            1.3.3 茶叶主要品质成分测定
            1.3.4 数据处理
    2 结果与分析
        2.1 纤维素酶分泌菌株对四川黑茶主要品质成分的影响
        2.2 果胶酶分泌菌株对四川黑茶主要品质成分的影响
    3 讨论与小结
参考文献
致谢
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本文编号：2886247