膨胀组织样品超分辨荧光显微镜的研制
发布时间：2021-07-09 07:07
随机光学重构显微技术（STORM）作为一种超分辨技术,打破了传统的衍射极限。它是利用可反复光开关的荧光标记实现的一种超高精度的单分子定位技术。利用这一原理获得的超分辨图像的横向分辨率可达20nm,轴向分辨率可达50nm,比衍射极限提高了一个数量级。由于可以得到超高分辨率的图像,STORM已经成为研究细胞特征学的重要工具。但是在组织成像方面,由于组织样品的高散射性和不均匀性,STORM在生物组织样品应用方面受到阻碍和限制。为了能够对生物组织样品进行STORM超分辨成像,我们一方面通过膨胀技术使组织样品均一化,透明化,减少由于散射和自发荧光造成的高背景;另一方面,我们自主搭建了一套光片照明显微成像系统,其具有成像速度快,光漂白和光损伤小的特点。为了活化荧光染料分子,我们在照明光路中引入双光子激光。由于双光子激光的非线性性,可以仅对视野中心的荧光染料分子起活化作用,减少不在视野中心的荧光染料分子不必要的光漂白。为了提升深度成像分辨率,我们在成像光路中加入自适应光学,利用闭环校正算法来校正成像系统本身以及成像缓冲液与成像物镜折射率不匹配导致的像差,从而实现厚组织样品内部的三维STORM超分辨成...
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１表达ｃｏｎｎｅｘｉｎ?４３－ＰａｍＣｈｅｒｒｙ的细胞球状体在不同ｚ位置的二维超分辨图像（被文??献丨１９］许可引用）??Ｂｅｔｚｉ组［２１］在２０１６照，记法
?第１章绪论???丢失或损坏的影响。２０１８年Ｓａｎｇｊｕｎ?Ｐａｒｋ等人［２５］采用线扫描共聚焦显微镜对样??■■■??ｍｍｍｍ?＾?ｍ??图１．２?ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞系中微管的超高分辨率图像（被文献丨２２】许可引用）??品进行光学切片，降低了背景噪声；采用纳米形貌中的ＤＮＡ点累积技术??（ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ），克服了厚样品中的快速光漂白问题，最终实现在小鼠脑切片组??织样品的１００微米深处对化学突触的超分辨成像。Ｊｅｏｎｇｍｉｎ?Ｋｉｍ等人［２６］于２０１９??年介绍了一种单分子倾斜平面显微镜（ｏｂＳＴＯＲＭ），它通过倾斜光片照明直接对??样品的斜切片成像，为组织样品和小型完整动物提供了一个增加深度和体积的??单分子定位显微平台。利用该方法实现了对６６ｐｍ深处细胞、秀丽隐杆线虫生??殖腺、黑腹果蝇幼虫大脑、小鼠视网膜和大脑切片以及整个棘鱼的超分辨率成??像。??对于ＳＴＯＲＭ／ＰＡＬＭ这种基于单分子定位的超分辨技术来说，单个荧光染??料分子发出的光子需要经过样品和成像透镜组之后才被照相机检测到。由于厚??的组织样品的折射率不均匀，荧光分子发出的波前通过组织的不同部分和结构，??会产生弯曲或变形，导致波前的畸变；并且光学系统固有的缺陷也会导致波前??畸变Ｐ７］。这些畸变降低了光子携带的分子位置信息，实际扭曲或模糊的点扩散??函数（ＰＳＦ）与假定或模拟的点扩散函数模型之间的差异进一步加剧了这种定??位偏差。这些都是阻碍单分子定位超分辨技术在组织样品中应用的重要因素。??伴随着自适应光学近些年来在显微镜中应用的发展，由于自适应光学对像差的??校正能力，使得搭配自适应光学的成像系统逐渐成为实现厚的组织样品中超
?第１章绪论???辨成像的一个有利的工具。??基于自适应光学的波前校正方法可以通过使用变形镜（Ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ?Ｍｉｒｒｏｒ）??恢复畸变波前的恒定相位延迟来补偿畸变。然而即使有了这些校正，由于波前??校正的可用方法和硬件的复杂性，实际的成像深度和单分子三维定位的鲁??棒性通常被限制在盖玻片表面的若干微米内。为了克服在组织深处轴向定位精??度下降的问题，Ｍｌｏｄｚｉａｎｏｓｋｉ等人＠］利用自适应光学在不同深度对点扩散函数??施加不同幅度的调制，从而达到趋于一致的效果；并开发出高效的Ｎｅｌｄｅｒ－Ｍｅａｄ??单纯形优化算法，从而实现鲁邦地组织样品三维超分辨率体积成像。如图１．３??所示，该工作实现了对３〇ｍｉｔｉ厚脑片样品的三维超分辨成像一一在阿尔兹海默??症的老鼠模型中重构和可视化ａｍｙｌｏｉｄ－Ｐ细丝的形态和纳米尺度的细节，比例??尺为５ｎｍ。??ｍＳＭ??ＨＢＢＢＢ??Ｉ?ｊ?ＨＢＢＩ??图１．３对阿尔茨海畎的老鼠３０ｆｕｎ厚脑片中ａｍｙｌｏｉｄ－ｐ斑块的三维超分辨成像（被文献丨３０｜??许可引用）??同时，先进的样品制备技术也可以减少组织样品的背景和散射，提高荧光??探针在免疫标记过程中的穿透深度［３１＿３２］。最近，Ｃｈｅｎ等人展示了一种新的方??５??
本文编号：3273286
【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．１表达ｃｏｎｎｅｘｉｎ?４３－ＰａｍＣｈｅｒｒｙ的细胞球状体在不同ｚ位置的二维超分辨图像（被文??献丨１９］许可引用）??Ｂｅｔｚｉ组［２１］在２０１６照，记法
?第１章绪论???丢失或损坏的影响。２０１８年Ｓａｎｇｊｕｎ?Ｐａｒｋ等人［２５］采用线扫描共聚焦显微镜对样??■■■??ｍｍｍｍ?＾?ｍ??图１．２?ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１细胞系中微管的超高分辨率图像（被文献丨２２】许可引用）??品进行光学切片，降低了背景噪声；采用纳米形貌中的ＤＮＡ点累积技术??（ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ），克服了厚样品中的快速光漂白问题，最终实现在小鼠脑切片组??织样品的１００微米深处对化学突触的超分辨成像。Ｊｅｏｎｇｍｉｎ?Ｋｉｍ等人［２６］于２０１９??年介绍了一种单分子倾斜平面显微镜（ｏｂＳＴＯＲＭ），它通过倾斜光片照明直接对??样品的斜切片成像，为组织样品和小型完整动物提供了一个增加深度和体积的??单分子定位显微平台。利用该方法实现了对６６ｐｍ深处细胞、秀丽隐杆线虫生??殖腺、黑腹果蝇幼虫大脑、小鼠视网膜和大脑切片以及整个棘鱼的超分辨率成??像。??对于ＳＴＯＲＭ／ＰＡＬＭ这种基于单分子定位的超分辨技术来说，单个荧光染??料分子发出的光子需要经过样品和成像透镜组之后才被照相机检测到。由于厚??的组织样品的折射率不均匀，荧光分子发出的波前通过组织的不同部分和结构，??会产生弯曲或变形，导致波前的畸变；并且光学系统固有的缺陷也会导致波前??畸变Ｐ７］。这些畸变降低了光子携带的分子位置信息，实际扭曲或模糊的点扩散??函数（ＰＳＦ）与假定或模拟的点扩散函数模型之间的差异进一步加剧了这种定??位偏差。这些都是阻碍单分子定位超分辨技术在组织样品中应用的重要因素。??伴随着自适应光学近些年来在显微镜中应用的发展，由于自适应光学对像差的??校正能力，使得搭配自适应光学的成像系统逐渐成为实现厚的组织样品中超
?第１章绪论???辨成像的一个有利的工具。??基于自适应光学的波前校正方法可以通过使用变形镜（Ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅ?Ｍｉｒｒｏｒ）??恢复畸变波前的恒定相位延迟来补偿畸变。然而即使有了这些校正，由于波前??校正的可用方法和硬件的复杂性，实际的成像深度和单分子三维定位的鲁??棒性通常被限制在盖玻片表面的若干微米内。为了克服在组织深处轴向定位精??度下降的问题，Ｍｌｏｄｚｉａｎｏｓｋｉ等人＠］利用自适应光学在不同深度对点扩散函数??施加不同幅度的调制，从而达到趋于一致的效果；并开发出高效的Ｎｅｌｄｅｒ－Ｍｅａｄ??单纯形优化算法，从而实现鲁邦地组织样品三维超分辨率体积成像。如图１．３??所示，该工作实现了对３〇ｍｉｔｉ厚脑片样品的三维超分辨成像一一在阿尔兹海默??症的老鼠模型中重构和可视化ａｍｙｌｏｉｄ－Ｐ细丝的形态和纳米尺度的细节，比例??尺为５ｎｍ。??ｍＳＭ??ＨＢＢＢＢ??Ｉ?ｊ?ＨＢＢＩ??图１．３对阿尔茨海畎的老鼠３０ｆｕｎ厚脑片中ａｍｙｌｏｉｄ－ｐ斑块的三维超分辨成像（被文献丨３０｜??许可引用）??同时，先进的样品制备技术也可以减少组织样品的背景和散射，提高荧光??探针在免疫标记过程中的穿透深度［３１＿３２］。最近，Ｃｈｅｎ等人展示了一种新的方??５??
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