萜类环化酶催化产物选择性机理研究

发布时间：2021-10-11 07:19

　　萜类酶的产物不专一性在萜类酶中十分常见,并与倍半萜类天然产物的多样性相关。对其突变型研究常常产生与野生型酶不一样的产物分布结果,甚至出现新的产物。这与蛋白质工程中,通过设计改造蛋白,增强催化活性或获得新的催化功能相契合,引起了科学家对研究萜类酶特别是萜类酶的突变体的兴趣。在本文中,我们选取了有代表性的倍半萜合酶Trichodiene合酶（TDS）作为研究对象,采用计算模拟的方法对其主副产物的产生机制及关键残基对酶催化影响机制进行探索。通过双层（dual-level）QM/MM模拟方法和密度泛函理论分别对TDS催化机制和气相中反应机理进行了理论计算。选用了三环副产物α-barbatene作为对照,与产生两环主产物trichodiene反应机理进行比较,探究TDS对主副产物的化学选择根源。研究表明TDS对于这两种产物的关键选择分歧点在于中间体cuprenyl cation,反应过程中关键步骤发生不同的甲基的转移。合成trichodiene路径中转移竖直C12甲基,在酶体系中需要跨越8.19 kcal/mol能垒,气相反应经历4.6 kcal/mol能垒。而TDS催化合成α-barbaten... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

倍半萜烯的2种环化方式，Trichodiene合成机制及两种以TD为前体的毒素

吉林大学硕士学位论文示与Mg2+离子配位）A亚基不含Mg2+-PPi区，说明TDS酶的两个亚基可能并不同时发生作用。图1.1倍半萜烯的2种环化方式，Trichodiene合成机制及两种以TD为前体的毒素图1.2TDS酶结构及活性位点[24]4

吉林大学硕士学位论文图1.3TDS酶产生的主要倍半萜烯产物对在高度保守的天冬氨酸富集区（DDXXD）以及倍半萜中常见的NSE区（NDXXSXXXE）进行定点诱变实验（表1.2，表1.3）的结果表示，一些突变如N225D、Y295F，被鉴定出了更加明显的副产物β-Bisabolene的产生，而D100E突变中发现以前未检测到的一些倍半萜烯产品，α-acoradiene。[26]但同时突变对于酶活性造成一定的影响，N225D、S229T以及R304K等突变体kcat明显下降，而D104E、Y295F等突变型，酶活性基本保持不变。[25,26]造成酶活性降低甚至失活的一个主要原因是选择的D100、N225、R304和Y305等残基主要用于配位Mg2+以及PPi焦磷酸基团，这些残基对于稳定Mg2+、PPi基团电荷帮助PPi基团从FPP上离去有十分重要的贡献，突变与Mg2+离子配位或与PPi形成氢键的残基一定程度上会改变活性口袋的口袋体积大小，导致酶活性位点不完全关闭，使得底物提前释放产生如farnesene和bisabolene等副产物。稳态动力学实验支持该结论，表明TDS酶催化反应中，从酶活性位点释放trichodiene是整个反应的限速步骤，而中间体(3R)-NPP未被检测到，表明NPP的转化为产物的速度非常快，那么FPP到NPP的重排是限制TDS酶反应途径中催化速率的关键步骤。[27]而Y295F，并不参与配位，但减少的羟基适当增大了活性位点处的孔隙大小，以及，在不影响酶的催化活性的情况下，大大增加了副产物β-Bisabolene的产率。6


本文编号：3430050