产乳酸的纤维素原料处理—固定化米根霉产果胶酶的研究

发布时间：2017-07-08 17:26

  本文关键词：产乳酸的纤维素原料处理—固定化米根霉产果胶酶的研究

  更多相关文章： 米根霉 果胶 果胶酶 固定化 半连续化发酵

【摘要】：L-乳酸是生物医用高分子材料聚乳酸合成的单体。由于聚乳酸具有良好的生物相容性和可降解性,在生物医药和环保领域都得到广泛的关注。随着聚乳酸研究的迅速发展,乳酸的生产日益受到重视。米根霉由于具备营养需求低,产出的L-乳酸光学纯度高,易于分离等特点,成为了目前制备高光学纯度L-乳酸的主要菌种。然而米根霉发酵L-乳酸的工业化过程中底物成本是个难题。生物质资源—天然纤维素(烟梗等)由于成本低廉和来源丰富,被认为是生产乳酸的有效碳源。可是由于果胶将纤维素、半纤维素和木质素紧密的缠绕在一起,造成微生物利用天然纤维素生产乳酸的困难,增加了酶制剂的费用,削弱了节约原料费用的优势。一般生物质的非酸预处理方法对半纤维素和果胶的处理不够,而生物酶法和微生物法,能去除生物质中的果胶和半纤维素等。微生物(如米根霉等)产生的果胶酶能降解天然纤维素中的果胶,同时果胶酶被广泛用于食品、纺织、医药等领域,其市场需求量日益增长。本文采用有产果胶酶能力且富有商业价值的安全菌种—米根霉,使用实验室开发的棉布载体固定化细胞的技术进行发酵产果胶酶,以期实现半连续化产酶和降解烟梗果胶的目标,为米根霉利用烟梗生产乳酸做准备。首先从纯果胶发酵产果胶酶出发,研究了固定化发酵与游离两种方式,优化了纯果胶培养基和培养条件,模拟了单批次发酵菌体生长动力学行为,还进行半连续发酵实验;然后优化了烟梗浸出液培养基和培养条件,模拟了单批次发酵菌体生长动力学行为,还进行半连续发酵实验;最后将发酵粗酶液应用于降解烟梗果胶,还采用固定化米根霉发酵烟梗粉末的方法降解烟梗果胶。首先,对纯果胶发酵产果胶酶进行研究。固定化与游离相比发酵周期减少33%,产酶量提高115%。通过对培养基和培养条件的优化得到:果胶2.5%,硫酸铵1.5%,ZnSO40.6 mmol/L,Tween80 0.15%,K2HPO4 0.4%,KH2PO4 0.4%,转速190r/min、装液量50mL/250mL、发酵温度30oC、发酵p H 5.0、孢子浓度0.75×106个/mL。在单批次发酵中,固定化米根霉生长动力学符合Logistic方程,生长与产酶部分偶联,24h后果胶酶(PEC)酶活力和聚半乳糖醛酸内切酶(Endo-PG)酶活力分别为973.47U/mL和165.08U/mL。半连续发酵研究表明在第5批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力,分别为1 253.95U/mL和181.94U/mL,分别比首次提高29.8%和18.3%,达到或高于目前固定化细胞产果胶酶的水平。其次,对烟梗浸出液发酵产果胶酶进行研究。通过对培养基和培养条件的优化得到:烟梗10%,硫酸铵1.5%,ZnSO40.6 mmol/L,Tween80 0.1%,K2HPO4 0.2%,KH2PO4 0.2%,发酵pH 5.0,孢子浓度0.5×106,,发酵温度30oC,装液量50mL,转速170r/min。在单批次发酵中,发现固定化米根霉生长与产酶偶联,48h后PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为361.27U/mL和49.22U/mL。半连续发酵研究表明在第2批次出现最高PEC酶活力和Endo-PG酶活力,分别为430.83U/mL和51.73U/mL,PEC酶活力比首批次提高22.8%。最后,将发酵所得粗酶液应用于降解烟梗果胶的研究和采用固定化米根霉直接发酵烟梗粉末的方法降解烟梗果胶。纯果胶发酵所得粗酶液在酶活力600U/mL和液料比20时,烟梗果胶降解率为55.6%,纤维素相对含量提高130%。烟梗浸液发酵所得粗酶液在酶活力300U/mL和液料比15时,果胶降解率为37.5%,纤维素相对含量提高88%。烟梗发酵研究中,确定培养基为:烟梗2.0%,葡萄糖0.6%,硫酸铵0.3%,ZnSO4 0.6 mmol/L,Tween80 0.1%,K2HPO4 0.2%,KH2PO4 0.2%;在与烟梗浸液发酵相同培养条件下,24h后PEC酶活力和Endo-PG酶活力最高分别为342.10U/mL和52.67U/mL。固定化米根霉发酵烟梗粉末研究表明,96h后烟梗果胶降解率为74.1%,半纤维素降解率为54.5%,纤维素降解率为13.3%。总之,本研究基于米根霉利用木质纤维素原料中果胶和纤维素的先后顺序不同,期望在利用纤维素原料中果胶产果胶酶后,再进行纤维素的酶解液产乳酸。本研究实现了以橘皮果胶、烟梗为原料的固定化米根霉半连续产果胶酶和降解烟梗中大部分果胶的目标,不仅有利于解决乳酸生产过程中果胶带来的系列问题,还可以产生果胶酶,为米根霉利用天然纤维素资源生产乳酸提供了一种新的微生物的预处理方法。
【关键词】：米根霉 果胶 果胶酶 固定化 半连续化发酵
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ925.3
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-12
• 1 绪论12-26
• 1.1 问题的提出及研究意义12-13
• 1.1.1 问题的提出12-13
• 1.1.2 研究意义13
• 1.2 国内外研究现状13-23
• 1.2.1 果胶分布、化学结构和分类13-15
• 1.2.2 纤维素原料中果胶的处理15-16
• 1.2.3 果胶酶分类和作用方式16-17
• 1.2.4 果胶酶生产菌种—米根霉17-18
• 1.2.5 真菌PG的诱导表达18-19
• 1.2.6 微生物产果胶酶条件优化研究现状19
• 1.2.7 固定化细胞产果胶酶的研究进展19-21
• 1.2.8 果胶酶生产过程中的影响因素21-23
• 1.2.9 果胶酶的应用23
• 1.3 本课题研究的目的及主要内容23-26
• 1.3.1 研究目的23
• 1.3.2 本课题研究的主要内容23-24
• 1.3.3 创新点24-26
• 2 棉布载体固定化发酵产果胶酶的研究26-34
• 2.1 前言26
• 2.2 材料和方法26-30
• 2.2.1 菌种26
• 2.2.2 主要仪器和试剂26-27
• 2.2.3 培养基27
• 2.2.4 载体的制备27-28
• 2.2.5 发酵培养方法28-29
• 2.2.6 分析方法29-30
• 2.3 结果分析30-32
• 2.3.1 酶液稀释倍数的确定30-31
• 2.3.2 游离发酵与固定化发酵的比较31-32
• 2.4 讨论32
• 2.4.1 酶液稀释倍数对酶活力测定准确性的影响32
• 2.4.2 游离发酵与固定化发酵32
• 2.5 小结32-34
• 3 固定化发酵果胶酶纯果胶培养基的优化34-44
• 3.1 前言34
• 3.2 材料和方法34-36
• 3.2.1 菌种34-35
• 3.2.2 主要仪器和试剂35
• 3.2.3 培养基35
• 3.2.4 发酵培养方法35
• 3.2.5 分析方法35-36
• 3.3 结果分析36-42
• 3.3.1 碳源种类的选择36-37
• 3.3.2 果胶浓度选择37
• 3.3.3 氮源种类选择37-38
• 3.3.4 硫酸铵浓度选择38-39
• 3.3.5 Tween80对产酶的影响39
• 3.3.6 金属离子的对产酶的影响39-41
• 3.3.7 发酵培养基的正交实验41-42
• 3.4 讨论42-43
• 3.4.1 碳源种类及果胶浓度对产酶的影响42
• 3.4.2 氮源种类及碳氮比对产酶的影响42
• 3.4.3 Tween80对产酶的影响42-43
• 3.4.4 金属离子对产酶的影响43
• 3.4.5 正交实验结果分析43
• 3.5 小结43-44
• 4 纯果胶培养基半连续发酵果胶酶44-56
• 4.1 前言44
• 4.2 材料和方法44-45
• 4.2.1 菌种、主要仪器和试剂44
• 4.2.2 培养基44-45
• 4.2.3 发酵培养方法45
• 4.2.4 分析方法45
• 4.3 结果分析45-52
• 4.3.1 转速的选择45-46
• 4.3.2 装液量选择46
• 4.3.3 温度选择46-47
• 4.3.4 初始pH的选择47-48
• 4.3.5 初始孢子浓度的选择48
• 4.3.6 固定化细胞产酶动力学行为48-50
• 4.3.7 半连续发酵实验50
• 4.3.8 粗酶液部分酶学性质50-52
• 4.4 讨论52-54
• 4.4.1 转速和装液量对产酶的影响52
• 4.4.2 pH对产酶的影响52
• 4.4.3 初始孢子浓度对产酶的影响52
• 4.4.4 固定化细胞产酶动力学行为分析52-53
• 4.4.5 半连续发酵的稳定性53
• 4.4.6 粗酶液部分酶学性质53-54
• 4.5 小结54-56
• 5 固定化发酵果胶酶烟梗浸液培养基的优化56-62
• 5.1 前言56
• 5.2 材料和方法56-57
• 5.2.1 试剂和设备56
• 5.2.2 烟梗浸液的制备56-57
• 5.2.3 培养基及发酵培养方法57
• 5.2.4 分析方法57
• 5.3 结果分析57-61
• 5.3.1 两种制备烟梗浸液方法的比较57
• 5.3.2 烟梗浓度的选择57-58
• 5.3.3 硫酸铵浓度的选择58-59
• 5.3.4 Zn~(2+)离子浓度的选择59
• 5.3.5 Tween80浓度的选择59-60
• 5.3.6 发酵培养基的正交实验60-61
• 5.4 讨论61
• 5.4.1 制备烟梗浸液方法61
• 5.4.2 培养基的优化61
• 5.5 小结61-62
• 6 烟梗浸液培养基半连续发酵果胶酶62-68
• 6.1 前言62
• 6.2 材料和方法62-63
• 6.2.1 试剂和设备62
• 6.2.2 烟梗浸液的制备62
• 6.2.3 培养基及发酵培养方法62
• 6.2.4 分析方法62-63
• 6.3 结果分析63-65
• 6.3.1 初始pH的选择63
• 6.3.2 初始孢子浓度的选择63-64
• 6.3.3 固定化细胞产酶动力学行为64-65
• 6.3.4 半连续发酵实验65
• 6.4 讨论65-66
• 6.4.1 发酵条件的优化65
• 6.4.2 固定化细胞产酶动力学行为分析65-66
• 6.4.3 半连续发酵的稳定性66
• 6.5 小结66-68
• 7 生物酶法和微生物法去除烟梗中果胶的优化68-80
• 7.1 前言68
• 7.2 材料和方法68-71
• 7.2.1 材料68
• 7.2.2 试剂和设备68-69
• 7.2.3 分析方法69-71
• 7.3 结果分析71-77
• 7.3.1 粗酶液A降解烟梗果胶质实验71-72
• 7.3.2 粗酶液B降解烟梗果胶质实验72-73
• 7.3.3 固定化米根霉发酵烟梗粉末的优化73-76
• 7.3.4 烟梗经处理后各组分的变化76-77
• 7.4 讨论77-78
• 7.4.1 烟梗粉末培养基的优化和产酶分析77
• 7.4.2 果胶酶和米根霉去除烟梗果胶的效果77
• 7.4.3 米根霉对烟梗木质纤维素处理效果的分析77-78
• 7.5 小结78-80
• 8 结论与展望80-82
• 8.1 结论80-81
• 8.2 对后续工作的展望81-82
• 致谢82-84
• 参考文献84-92
• 附录92
• A．作者在攻读学位期间发表的论文目录92
• B．参与的科研项目92

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