利用工程大肠杆菌生物法合成香叶醇的发酵工艺研究

发布时间：2017-07-29 05:07

  本文关键词：利用工程大肠杆菌生物法合成香叶醇的发酵工艺研究

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【摘要】：香叶醇作为一种广泛应用于香精香料、日化、食品、药物等领域的无环单萜烯醇,市场需求旺盛。目前植物提取和化学合成是香叶醇的两种主要合成方法,然而这两种合成方法存在许多问题,如成本高、污染环境、选择性差等等,则以廉价、可再生的生物质为原料生物法合成香叶醇成为了发展趋势。本论文首先构建了以葡萄糖为原料,生物法合成香叶醇的工程大肠杆菌；然后在摇瓶水平进行发酵条件和发酵培养基的优化,提高香叶醇产量；最后放大到5L发酵罐水平获得高产量的香叶醇,并对年产2500吨香叶醇的发酵生产工艺进行了设计。论文的主要内容和取得的主要结论包括以下几个方面：(1)利用分子生物学技术,通过在大肠杆菌体内表达甲羟戊酸(MVA)生物合成途径及香叶醇合成酶GES基因,构建了以葡萄糖为原料,生物法合成香叶醇的代谢途径：通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测确定发酵产物为香叶醇,并建立了香叶醇的气相色谱(GC)定量检测方法,得到其定量标准曲线。(2)摇瓶水平发酵条件和发酵培养基的优化：利用单因素的实验方法进行发酵条件的优化,优化后的发酵条件为：诱导时间为菌体的OD600nm值1.0左右,诱导剂IPTG浓度为1.0mM,诱导温度为30℃,pH为6.0,转速为180r/min,并将优化条件用于培养基的优化实验中。利用响应面法优化发酵培养基：首先运用Plackett-Burman实验筛选培养基中影响香叶醇产量的关键因素：再运用最陡爬坡法使关键因素的浓度接近最佳响应区域；最后通过中心组合设计确定了关键因素的最佳浓度及回归模型。结果表明,柠檬酸铁铵、硫酸镁和微量元素为影响香叶醇产量的关键因素,培养基中关键组分的最佳浓度为：柠檬酸铁铵0.13g/L,硫酸镁17.6mmol/L,微量元素16.7ml/L。优化后香叶醇产量从最初的50.12mg/L提高到223.24mg/L,相比初始的发酵条件和培养基产量提高到4.45倍。(3)5L发酵罐水平发酵工艺的探究：在5L发酵罐水平建立了香叶醇的发酵工艺。由于香叶醇具有抑菌性和挥发性,在发酵过程中采用双相发酵,即发酵过程中添加萃取剂肉豆蔻酸异丙酯,实现了发酵和分离的同时进行,最终达到了香叶醇的稳定生产。经过48h的诱导培养,菌体的OD600nm值为45左右,香叶醇浓度达到2g/L左右,收率为3.5%左右(理论收率28.5%)。(4)对于生物法合成香叶醇的工业化生产进行了设计,生产过程采用双相发酵,设计目标是年产2500吨香叶醇(纯度≥90%),收率达到18%(理论收率28.5%),设计主要包括了工艺的设计与计算、主要设备的选型与计算和工艺流程图的绘制。
【关键词】：香叶醇 工程大肠杆菌 响应面分析方法 优化 设计
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ929
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 0 引言12-13
• 1 文献综述13-28
• 1.1 生物法合成萜类化合物的研究进展13-17
• 1.1.1 萜类化合物的简介13-14
• 1.1.2 生物法合成途径14-16
• 1.1.3 生物法合成萜类化合物的研究进展16-17
• 1.2 香叶醇介绍17-20
• 1.2.1 香叶醇的物理化学性质简介17
• 1.2.2 香叶醇的用途17-18
• 1.2.3 香叶醇的合成方法及研究现状18-20
• 1.3 发酵工艺优化概述20-26
• 1.3.1 培养基对发酵的影响20-22
• 1.3.2 培养条件对发酵的影响22-24
• 1.3.3 发酵优化的试验设计方法24-26
• 1.4 本课题的主要研究内容和意义26-28
• 1.4.1 本课题的主要研究内容26-27
• 1.4.2 研究意义27-28
• 2 生物法合成香叶醇的初步探究实验28-43
• 2.1 实验材料29-32
• 2.1.1 菌株和质粒29
• 2.1.2 主要试剂29-31
• 2.1.3 主要仪器31-32
• 2.1.4 培养基32
• 2.2 实验方法32-37
• 2.2.1 工程大肠杆菌的构建32-36
• 2.2.2 发酵产物的验证36
• 2.2.3 香叶醇检测方法的建立36-37
• 2.3 结果与讨论37-42
• 2.3.1 工程大肠杆菌的构建37-39
• 2.3.2 发酵产物的验证39-40
• 2.3.3 香叶醇定量标准曲线的绘制40-42
• 2.4 本章小结42-43
• 3 摇瓶水平发酵培养基与发酵条件的优化43-59
• 3.1 实验材料43
• 3.2 实验方法43-45
• 3.2.1 发酵条件的优化43-44
• 3.2.2 发酵培养基的优化44-45
• 3.2.3 优化条件和优化培养基对香叶醇产量提高的检验45
• 3.3 结果与讨论45-58
• 3.3.1 发酵条件的优化45-50
• 3.3.2 发酵培养基的优化50-57
• 3.3.3 优化条件和优化培养基对香叶醇产量提高的检验57-58
• 3.4 本章小结58-59
• 4 5L发酵罐水平发酵工艺的探究59-66
• 4.1 实验材料59
• 4.2 实验方法59-61
• 4.2.1 常规发酵59-60
• 4.2.2 外源添加香叶醇标品发酵60
• 4.2.3 双相发酵60-61
• 4.3 结果与讨论61-65
• 4.3.1 常规发酵61-62
• 4.3.2 外源添加香叶醇标品发酵62-63
• 4.3.3 双相发酵63-65
• 4.4 本章小结65-66
• 5 年产2500吨香叶醇的发酵生产工艺设计66-75
• 5.1 生产工艺流程的设计与计算66-69
• 5.1.1 生产工艺步骤与流程示意图66-68
• 5.1.2 物料衡算68-69
• 5.2 主要设备的选型与计算69-74
• 5.2.1 发酵罐的选型与设计69-73
• 5.2.2 主要设备一览表73-74
• 5.3 “三废”排放及处理74-75
• 6 结论与展望75-77
• 6.1 结论75-76
• 6.2 展望76-77
• 参考文献77-81
• 附录81-82
• 致谢82-83
• 个人简历83
• 发表的学术论文83

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本文编号：587554