基于适配体荧光传感器检测IgE的方法研究

发布时间：2017-07-31 06:10

  本文关键词：基于适配体荧光传感器检测IgE的方法研究

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【摘要】：免疫球蛋白E(IgE)是一种分泌型免疫球蛋白,在人类过敏反应中起关键作用。一般情况下,IgE在人血清中的含量很低,然而在过敏性哮喘、过敏性皮炎或其他免疫缺陷病的病人血清内,IgE含量会升高。因此,建立简便、快速、灵敏的IgE的检测方法对于过敏性疾病的临床诊断至关重要。本文结合荧光光谱分析技术和具有高特异性识别能力的核酸适配体,建立了一种基于能量共振转移原理的荧光传感器检测IgE的方法。本文以花菁类荧光染料——Cy5和水溶性好的碳纳米材料——氧化石墨烯(GO)分别作为荧光能量的供体和受体。当5’端标记有Cy5的IgE的适配体核酸链和GO同时存在时,它们之间产生π-π共轭堆积作用,而被稳定地吸附在GO的表面,Cy5与GO靠近,发生能量共振转移,Cy5的荧光被猝灭。当IgE存在时,核酸适配体与其特异性结合形成蛋白质-适配体复合物,GO对复合物吸附能力减弱,复合物脱离GO的表面,Cy5的荧光信号得到恢复。实验首先采用三维荧光光谱(3D-EMM)分析法对Cy5标记适配体后的荧光性质进行了分析,确定了633 nm为激发波长(Ex),675 nm为发射波长(Em)。然后,根据荧光猝灭性能对氧化石墨烯(GO)等四种碳纳米材料进行了选择,优化了检测体系的pH值和离子强度(Mg2+浓度),考察了适配体和IgE的孵育温度和时间。结果表明,GO为最佳猝灭剂,检测体系pH值为7.4,Mg2+浓度为1 mmol/L,37℃条件下,孵育30 mmin时,荧光信号恢复的响应值最高。在最佳的实验条件下,对不同浓度的IgE溶液进行检测,得到0.05-10 nmol/L的线性范围,检出限为0.001nmol/L。与IgE结构相似的IgG(免疫球蛋白G)和血清中大量存在的HSA(人血清白蛋白)在高浓度时对实验体系的响应值很低,说明本方法具有好的选择性和高的特异性。将本文建立的方法对血清样品中IgE含量进行检测,用经典的酶联免疫法(ELISA)对检测结果进行验证,两种方法具有很好的一致性,因此说明本文方法高效、快速、灵敏,在实际临床应用中存在很大的潜力。
【关键词】：适配体 IgE 荧光传感 氧化石墨烯 检测
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6;O657.3
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-27
• 1.1 核酸适配体8-16
• 1.1.1 核酸适配体的筛选9
• 1.1.2 核酸适配体的特性9-10
• 1.1.3 核酸适配体与配体目标物的作用10-11
• 1.1.4 核酸适配体的应用领域11-13
• 1.1.5 适配体传感器13-16
• 1.2 荧光适配体传感器16-21
• 1.2.1 荧光传感器16
• 1.2.2 荧光传感器的分类16-19
• 1.2.3 适配体荧光传感器19-21
• 1.3 氧化石墨烯21-23
• 1.3.1 氧化石墨烯概述21-22
• 1.3.2 氧化石墨烯在荧光传感器中的应用22-23
• 1.4 免疫球蛋白E23-26
• 1.4.1 免疫球蛋白E的概述23-24
• 1.4.2 免疫球蛋白E检测方法24
• 1.4.3 核酸适配体在免疫球蛋白E检测方法的应用与发展24-26
• 1.5 本课题研究的主要内容26-27
• 2 材料与方法27-33
• 2.1 实验材料27-30
• 2.1.1 化学试剂27
• 2.1.2 生物试剂27-28
• 2.1.3 实验仪器和材料28
• 2.1.4 待测样品28-29
• 2.1.5 主要溶液的配制29-30
• 2.2 实验方法30-33
• 2.2.1 孵育条件30
• 2.2.2 光谱条件30
• 2.2.3 标准曲线的绘制30-31
• 2.2.4 条件的优化31-32
• 2.2.5 样品前处理32
• 2.2.6 方法验证32-33
• 3 结果与讨论33-48
• 3.1 实验原理33
• 3.2 最佳激发和发射波长的确定33-36
• 3.3 Cy5与FAM的比较36-37
• 3.4 猝灭材料的选择37-39
• 3.4.1 水体系37-38
• 3.4.2 PBS体系38-39
• 3.5 G0最佳浓度的确定39-40
• 3.6 离子强度的选择40-42
• 3.7 pH的优化42-43
• 3.8 温度的选择43-44
• 3.9 孵育时间44-45
• 3.10 标准曲线的建立45-46
• 3.11 特异性验证46-47
• 3.12 方法验证47-48
• 4 结论48-49
• 5 展望49-50
• 6 参考文献50-58
• 7 硕士期间发表论文情况58-59
• 8 致谢59

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本文编号：597765