深海中产蛋白酶菌株的筛选及酶学性质分析

发布时间：2017-08-09 10:10

  本文关键词：深海中产蛋白酶菌株的筛选及酶学性质分析

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【摘要】：蛋白酶是工业上主要用酶之一,广泛应用在食品、化妆品和医药等领域。其中,冷适蛋白酶在食品加工和化妆品应用方面有中温蛋白酶无法取代的优势,其最显著的三大特点为最适温度一般在10℃-45℃、0-30℃范围内催化效率较高、热稳定性比中温酶差。本论文从深海沉积物中筛选到一株产蛋白酶菌株,并对其进行菌种鉴定、培养基组成和发酵条件的优化及酶液的酶学性质分析,为冷适酶的开发应用提供基础研究。结果如下：通过对菌株的形态学观察和生理生化指标分析,确定该菌株为革兰氏阳性菌株,能够利用多种糖源发酵,接触酶试验和甲基红试验为阴性,硝酸盐,精氨酸双水解酶试验和VP试验为阳性。进一步对该菌株的16S rDNA序列比对,发现其与Bacillus subtilis strain Acj 115有较近的亲缘关系,确定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),命名为Bacillus subtilis.N-9。采用单因素试验和正交试验,在摇瓶水平上对菌株的发酵培养基组成和发酵条件进行优化,得到优化后的培养基组成为(g/L)：木糖25,蛋白胨35,酵母浸出物16,NaC110, KH2PO43, K2HPO47;优化后的发酵条件为：pH 5.5,装液量80 mL,种龄15 h,接种量3.5%,在以上优化后的发酵培养基组成和发酵条件进行发酵,测定蛋白酶酶活为306.93 U/mL,较优化之前提高了223.56%。采用硫酸铵分级沉淀对菌株发酵所产蛋白酶液进行初步纯化,分析该蛋白酶的酶学性质。作为一种冷适酶,该蛋白酶的最适温度为40℃；具有较高低温催化活性,0℃时蛋白酶活仍有7.05%的催化能力；也具有典型的冷适酶的热不稳定性,在60℃下保温15 min蛋白酶活力仅剩39%。该蛋白酶的最适pH为7.0,在pH为6.0-8.0范围内呈现良好的稳定性；金属离子对蛋白酶活力影响不明显；PMSF则强烈抑制酶活力,表明该蛋白酶为丝氨酸蛋白酶；表面活性剂SDS较Tween-80对蛋白酶活力的影响更为明显；该酶对有机溶剂甲醇、乙醇和甘油呈现良好的耐受性。
【关键词】：冷适蛋白酶 枯草芽孢杆菌 参数优化 酶学性质
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ925.2
【目录】：

• 摘要4-5
• abstract5-9
• 1 前言9-21
• 1.1 海洋环境9
• 1.2 海洋微生物分类9-11
• 1.2.1 海洋细菌10-11
• 1.2.2 海洋细菌多样性研究及意义11
• 1.3 低温微生物11-14
• 1.3.1 低温微生物的分布11-12
• 1.3.2 低温微生物的适冷机制12-14
• 1.4 冷适酶及适冷机制14-15
• 1.4.1 冷适酶14-15
• 1.4.2 冷适酶的适冷机制15
• 1.5 蛋白酶分类及作用特点15-17
• 1.5.1 金属蛋白酶16
• 1.5.2 丝氨酸蛋白酶16
• 1.5.3 天冬氨酸蛋白酶16
• 1.5.4 半胱氨酸蛋白酶16-17
• 1.6 冷适酶的应用17-20
• 1.6.1 冷适蛋白酶的研究现状17-18
• 1.6.2 冷适蛋白酶研究方面的不足18-19
• 1.6.3 冷适蛋白酶的应用19-20
• 1.7 本课题立题背景和意义20-21
• 2 材料和方法21-36
• 2.1 实验材料21-27
• 2.1.1 菌株和质粒21
• 2.1.2 工具酶及相关试剂21-23
• 2.1.3 主要仪器和设备23-24
• 2.1.4 培养基和主要溶液24-27
• 2.1.5 实验所用引物27
• 2.2 实验方法27-36
• 2.2.1 产蛋白酶菌株的筛选27-28
• 2.2.2 菌株鉴定28-32
• 2.2.3 发酵时间对菌株生长及产酶的影响32
• 2.2.4 菌株发酵培养基组分的优化32-33
• 2.2.5 菌株发酵培养条件的优化33-34
• 2.2.6 菌株酶学性质的研究34-36
• 3 结果与讨论36-49
• 3.1 产蛋白酶菌株的筛选36-37
• 3.1.1 蛋白酶生产菌株的初筛36
• 3.1.2 蛋白酶生产菌株的复筛36-37
• 3.2 菌株鉴定37-40
• 3.2.1 菌株的形态学观察37
• 3.2.2 生理生化特性37-38
• 3.2.3 系统发育树分析38-39
• 3.2.4 鉴定结果39-40
• 3.3 培养时间对菌株生长及产酶的影响40
• 3.4 菌株发酵培养基组分的优化40-45
• 3.4.1 碳源试验40-41
• 3.4.2 氮源试验41-43
• 3.4.3 不同浓度NaCl对蛋白酶活的影响43-44
• 3.4.4 正交试验确定最佳发酵培养基44-45
• 3.5 菌株发酵条件的优化45-49
• 3.5.1 pH对蛋白酶活的影响45-46
• 3.5.2 接种量对蛋白酶活的影响46-47
• 3.5.3 种龄对蛋白酶活性的影响47
• 3.5.4 装液量对蛋白酶活性的影响47-48
• 3.5.5 正交试验确定最佳发酵条件48-49
• 4 蛋白酶的酶学性质49-56
• 4.1 (NH_4)_2SO_4分级沉淀条件的确定49
• 4.2 蛋白酶酶学性质的分析49-56
• 4.2.1 酶的最适pH49-50
• 4.2.2 酶的pH稳定性50
• 4.2.3 酶的最适温度50-51
• 4.2.4 酶的热稳定性51-52
• 4.2.5 金属离子对蛋白酶酶活力的影响52-53
• 4.2.6 不同抑制剂对蛋白酶活力的影响53-54
• 4.2.7 表面活性剂对蛋白酶活性的影响54-55
• 4.2.8 有机溶剂对蛋白酶活力的影响55-56
• 5 结论56-57
• 6 展望57-58
• 7 参考文献58-65
• 8 攻读硕士学位期间发表论文情况65-66
• 9 致谢66

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本文编号：644717