pH及糖基化处理对菲律宾蛤仔原肌球蛋白性质的影响
本文关键词：pH及糖基化处理对菲律宾蛤仔原肌球蛋白性质的影响
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【摘要】：菲律宾蛤仔属于我国四大养殖贝类之一,不仅味道鲜美、营养丰富,还具有很高的经济价值。“吃蛤蜊,喝啤酒”也是青岛带给世界各地游客的独有体验。作为人类常见的食物过敏原之一,由菲律宾蛤仔引发的过敏性疾病发病率也日益增高。本论文以菲律宾蛤仔主要过敏原——原肌球蛋白为研究对象,系统分析了其理化性质,探究了pH变化及糖基化对原肌球蛋白过敏原性的影响,并采用生物信息学软件对其抗原表位进行初步分析,为认识菲律宾蛤仔过敏及消减其过敏原性提供基础数据。主要研究结果包括：1、分离并纯化了菲律宾蛤仔的主要过敏原——原肌球蛋白,并利用免疫学技术进行了鉴定。进一步对其理化性质进行表征发现,菲律宾蛤仔原肌球蛋白的分子量在37 kDa左右,等电点为5.1;糖含量为6.34%；对热比较稳定,经过沸水煮15 min,其IgG结合能力没有明显的变化。此外,采用RACE技术对表达原肌球蛋白的基因序列进行表征,发现其全长为855 bp,编码284个氨基酸。2、不同pH处理能够部分改变菲律宾蛤仔原肌球蛋白的过敏原性。在不同的pH环境条件下,采用间接酶联免疫吸附实验、点印记、蛋白酶酶解实验、圆二色谱、表面疏水性及紫外光谱等系统解析了原肌球蛋白分子结构与过敏原性的变化。结果表明,pH从7.0下降至1.0,原肌球蛋白的结构趋于松散,表面疏水性降低了97.7%,免疫活性降低；在pH9.0的碱性条件下,原肌球蛋白的过敏性有所增高。这说明采用低pH处理能够部分降低菲律宾蛤仔的过敏原性。3、核糖引发的美拉德反应能够有效降低菲律宾蛤仔原肌球蛋白的过敏原性。在核糖的作用下,原肌球蛋白发生美拉德反应,采用酶联免疫、点印记、圆二色谱、赖氨酸含量等对核糖与原肌球蛋白的美拉德反应产物进行解析,结果表明,在核糖作用12h后,原肌球蛋白的二级结构发生的明显的变化,α-螺旋含量下降了71.7%,蛋白表面疏水性增加了192%,有效赖氨酸含量降低了45.5%,过敏原性变化分析显示,美拉德反应产物的IgE结合能力下降76.2%,IgG结合能力下降86.8%。由此表明,核糖能够有效降低菲律宾蛤仔原肌球蛋白的过敏原性。。4、利用生物信息软件对菲律宾蛤仔原肌球蛋白的抗原表位进行预测分析。结果表明,原肌球蛋白的氨基酸序列较为保守,不同种类软体动物的序列之间同源性达到75%以上,有的可以达到90%以上。采用DNAstar、AntheProt生物信息学软件并结合2个在线网站对原肌球蛋白的线性表位区域进行预测,得到10个抗原表位。这些表位在整个序列中的分布较为平均,有7个肽段的位置与已经报道的表位区域存在部分重合的现象,再根据之前的实验结果筛选可能性最高的四个表位进行Fmoc固相合成,采用竞争点印记方法,利用兔抗蛤蜊血清和过敏患者血清对其活性进行初步验证。4个多肽均为主要过敏原表位。综上所述,本研究对菲律宾蛤仔主要过敏原一一原肌球蛋白的理化性质进行解析,阐明了pH处理及糖基化处理对原肌球蛋白过敏原性的影响,并进一步利用生物信息学技术分析了原肌球蛋白的抗原表位。该研究结果对于认清菲律宾蛤仔过敏原的基本性质,开发低过敏性或无过敏性贝类食品,保障消费者食用安全等具有积极的意义。
【关键词】：过敏原 菲律宾蛤仔 原肌球蛋白 pH 糖基化 IgE结合活性
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS254.1
【目录】：
- 摘要5-7
- Abstract7-14
- 0 前言14-24
- 0.1 食物过敏原研究进展14-15
- 0.2 软体类过敏原概述15-17
- 0.2.1 软体类过敏原种类15-17
- 0.2.2 菲律宾蛤仔相关研究17
- 0.3 过敏原抗原性消减方法17-20
- 0.3.1 物理法18-19
- 0.3.2 化学法19
- 0.3.3 生物法19-20
- 0.4 表位研究概述20-22
- 0.5 研究目的和意义22-23
- 0.6 本论文的技术路线23-24
- 1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白性质分析24-39
- 1.1 引言24
- 1.2 实验材料24-28
- 1.2.1 主要试剂及生物材料24-25
- 1.2.2 实验仪器设备25-26
- 1.2.3 溶液配制步骤26-28
- 1.3 主要方法28-30
- 1.3.1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白纯化制备28-29
- 1.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)29
- 1.3.3 免疫印迹29
- 1.3.4 点印记29
- 1.3.5 双向电泳29-30
- 1.3.6 蛋白糖含量测定30
- 1.3.7 热稳定性30
- 1.3.8 差示扫描量热法测定蛋白的热性能30
- 1.3.9 蛋白克隆及测序30
- 1.4 结果与讨论30-37
- 1.4.1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白的纯化鉴定30-32
- 1.4.2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白等电点测定32-33
- 1.4.3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白糖含量测定33
- 1.4.4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白热稳定性33-34
- 1.4.5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白热性能34
- 1.4.6 菲律宾蛤仔原肌球蛋白克隆及测序34-37
- 1.5 本章小结37-39
- 2 不同pH条件下菲律宾蛤仔原肌球蛋白免疫活性变化39-53
- 2.1 引言39
- 2.2 实验材料39-41
- 2.2.1 主要试剂及生物材料39-40
- 2.2.2 实验仪器设备40
- 2.2.3 溶液配制步骤40-41
- 2.3 主要方法41-44
- 2.3.1 SDS-PAGE41
- 2.3.2 酶联免疫吸附实验41-42
- 2.3.3 点印记42
- 2.3.4 胃蛋白酶消化实验42-43
- 2.3.5 圆二色谱测定43
- 2.3.6 蛋白表面疏水性测定43
- 2.3.7 紫外全波长扫描43
- 2.3.8 数据分析43-44
- 2.4 结果与讨论44-52
- 2.4.1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下蛋白组分变化44-45
- 2.4.2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下IgG/IgE结合能力变化45-47
- 2.4.3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白抗酶解能力变化47-49
- 2.4.4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白圆二色谱扫描结果49-50
- 2.4.5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下疏水性变化50-51
- 2.4.6 菲律宾蛤仔原肌球蛋白在不同pH条件下紫外吸收光谱变化51-52
- 2.5 本章小结52-53
- 3 糖基化对菲律宾蛤仔原肌球蛋白免疫活性影响53-63
- 3.1 引言53
- 3.2 实验原料53-54
- 3.2.1 主要试剂及生物材料53-54
- 3.2.2 实验仪器设备54
- 3.2.3 溶液配制步骤54
- 3.3 主要方法54-55
- 3.3.1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白的糖基化改性54
- 3.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳54
- 3.3.3 圆二色谱54
- 3.3.4 蛋白表明疏水性测定54-55
- 3.3.5 反应产物中有效赖氨酸含量测定55
- 3.3.6 点印记55
- 3.3.7 酶联免疫吸附试验55
- 3.4 结果与讨论55-62
- 3.4.1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后蛋白组分变化55-56
- 3.4.2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后二级结构变化56-58
- 3.4.3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后疏水性变化58-59
- 3.4.4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后赖氨酸含量变化59-60
- 3.4.5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与核糖羰氨反应后IgG/IgE结合能力60-62
- 3.5 本章小结62-63
- 4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白线性表位初步筛选63-76
- 4.1 引言63
- 4.2 主要方法63-65
- 4.2.1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与其他5种原肌球蛋白过敏原同源性分析63-64
- 4.2.2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白抗原性指数分析64
- 4.2.3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的在线工具预测64
- 4.2.4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的综合分析预测64-65
- 4.2.5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与人和猪原肌球蛋白序列对比65
- 4.2.6 预测表位的合成及纯度分析65
- 4.2.7 合成表位活性分析65
- 4.3 结果与讨论65-75
- 4.3.1 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与其他5种原肌球蛋白过敏原同源性分析65-68
- 4.3.2 菲律宾蛤仔原肌球蛋白抗原性指数分析68
- 4.3.3 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的在线工具预测68-69
- 4.3.4 菲律宾蛤仔原肌球蛋白表位的综合分析预测69-72
- 4.3.5 菲律宾蛤仔原肌球蛋白与人和猪原肌球蛋白序列对比72-73
- 4.3.6 预测表位的合成及纯度分析73-74
- 4.3.7 合成表位活性分析74-75
- 4.4 本章小结75-76
- 5 论文总结76-78
- 6 论文的创新与展望78-79
- 参考文献79-88
- 致谢88-89
- 个人简历89
- 发表的学术论文89
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