DnaK蛋白质的纯化及其生物化学性质分析

发布时间：2017-08-20 12:35

  本文关键词：DnaK蛋白质的纯化及其生物化学性质分析

  更多相关文章： Hsp70s DnaK 二聚体 荧光偏振 色氨酸荧光分析

【摘要】：热休克蛋白70s(Heat shock proteins, Hsp70s)是从细菌到哺乳动物中均广泛存在的一类保守的蛋白质家族,是维持蛋白内稳态所必需的分子伴侣。DnaK,作为大肠杆菌中的重要的Hsp70蛋白质,常被当作研究Hsp70s的模型。通过分析DnaK-ATP复合物的空间结构,可知其呈现二聚体状态,且两个相同的单体通过氢键作用力形成典型的相互作用空间,在该空间内单体的表面结构高度互补。在本实验中,首先依据DnaK-ATP的空间结构,通过蛋白质交联实验证明了DnaK在ATP存在时确实能够形成特殊的二聚体。为了进一步理解此二聚体的生理意义,在二聚体的相互作用面上选择了5个重要氨基酸分别进行定点突变。体内生长测试结果显示四个突变R56A、T301A、N537A、D540A均可导致分子伴侣活性的降低,这也就暗示了DnaK二聚体的重要性。利用大肠杆菌诱导表达上述突变蛋白质,并采用硫酸镍亲和层析以及阴离子交换层析对其进行纯化。通过荧光偏振技术检测突变蛋白质与多肽底物的结合能力并与野生型DnaK蛋白质进行比较,利用PRISM软件分析其分离常数(Kd),结果显示这些突变体并不影响DnaK原有的与多肽的结合能力。进一步利用色氨酸特殊的荧光特性分析这些突变体是否影响ATP导致的DnaK变构耦合,实验结果显示,所有突变体与野生型并无明显差别,均产生6 nm左右的蓝移,也就是说上述二聚体突变并不能影响ATP导致的变构耦合。综上所述,DnaK在含有ATP的环境中确实能够形成二聚体,此二聚体结构对分子伴侣功能的发挥意义重大。破坏二聚体空间结构会极大地影响其分子伴侣活性,但并不影响DnaK原有的与底物的结合能力,也不能够影响ATP导致的变构耦合。
【关键词】：Hsp70s DnaK 二聚体 荧光偏振 色氨酸荧光分析
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：O629.73
【目录】：

• 摘要4-5
• ABSTRACT5-8
• 1 前言8-20
• 1.1 Hsp的研究概况8-10
• 1.1.1 Hsp的发现8-9
• 1.1.2 Hsp的分类9
• 1.1.3 Hsp应用研究的意义9-10
• 1.2 Hsp70的研究概况10-14
• 1.2.1 Hsp70的分类10
• 1.2.2 Hsp70的结构特征10-11
• 1.2.3 Hsp70的生物学功能11-13
• 1.2.4 Hsp70在食品科学领域中的应用13-14
• 1.3 DnaK的研究现状14-15
• 1.3.1 DnaK水解ATP反应14-15
• 1.4 蛋白质诱导纯化技术15-17
• 1.4.1 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达蛋白原理15-16
• 1.4.2 蛋白质表达纯化方法16-17
• 1.5 本课题研究的目的、意义及主要内容17-20
• 1.5.1 研究目的及意义17-18
• 1.5.2 本课题研究内容及技术路线18-20
• 2 材料与方法20-34
• 2.1 实验材料20-23
• 2.1.1 实验试剂20-22
• 2.1.2 实验器材22-23
• 2.2 实验方法23-34
• 2.2.1 DnaK定点突变DNA的制备23-26
• 2.2.2 蛋白质的诱导表达26-28
• 2.2.3 蛋白质的纯化28-31
• 2.2.4 蛋白质交联实验31
• 2.2.5 体内生长测试31-32
• 2.2.6 蛋白质与多肽结合实验32
• 2.2.7 色氨酸荧光分析32-34
• 3 结果与讨论34-49
• 3.1 定点突变质粒的构建34-36
• 3.2 蛋白质高效表达及纯化结果36-42
• 3.2.1 DnaK-WT蛋白质的高效表达36-37
• 3.2.2 Ni亲和层析柱纯化DnaK-WT37-40
• 3.2.3 阴离子交换柱纯化DnaK-WT40-41
• 3.2.4 DnaK突变体的纯化41-42
• 3.3 DnaK在ATP存在的情况下能够形成特殊的二聚体42-44
• 3.4 DnaK二聚体对机体正常生长具有重要作用44-45
• 3.5 DnaK二聚体突变体对多肽的结合无明显影响45-47
• 3.6 突变体对ATP导致的变构耦合无影响47-49
• 4 结论49-50
• 5 展望50-51
• 6 参考文献51-58
• 7 硕士期间发表论文情况58-59
• 8 致谢59-60
• 9 附录60

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本文编号：706698