乳酸菌发酵特性及其蛋白酶对凝乳品质影响研究

发布时间：2017-10-23 12:39

  本文关键词：乳酸菌发酵特性及其蛋白酶对凝乳品质影响研究

  更多相关文章： 乳酸菌 蛋白酶 酶学性质 凝乳 发酵乳品质

【摘要】：乳酸菌蛋白酶直接作用于乳中的酪蛋白,是乳酸菌降解系统的第一步,对乳酸菌在乳中的生长至关重要,对发酵乳制品风味和质地的形成以及品质具有重要的影响。本论文以实验室从传统发酵食品中分离的乳酸菌为研究对象,确定具有促进凝乳质量蛋白酶的乳酸菌,研究其蛋白酶性质及其对凝乳理化性质和凝块品质的影响,旨在通过研究乳酸菌蛋白酶特性来选择优良酸奶生产用菌种,为高品质发酵乳的生产提供理论依据和基础。通过对现有乳酸菌发酵乳的质构分析,发现123株乳酸菌中有69株具有结实的凝乳效果,依据这69株乳酸菌蛋白水解度的不同,筛选出12株凝乳结实且蛋白水解度高的乳酸菌,并对筛选菌株的蛋白水解力和蛋白酶活力进行研究,发现同一种属的不同菌株水解蛋白的能力也存在显著差异。分析筛选菌株的蛋白水解度和发酵性能,发现中等程度的蛋白水解有利于凝胶硬度的增加,而发酵乳表观黏度随着蛋白水解度的增加而降低,菌株蛋白水解度对发酵乳粒度的影响不显著。通过研究这12株乳酸菌蛋白酶粗酶对葡萄糖酸内酯(GDL)乳凝胶质量的影响,筛选出3株对GDL乳凝胶质量促进作用最显著的菌株CH9-3 4.0、SH3 4.3和SB5。经16S r DNA序列分析和API细菌鉴定系统,确定这3株菌属于德氏乳杆菌保加利亚亚种。为获得上述3株保加利亚乳杆菌蛋白酶,本论文对分离纯化的方法和参数条件进行了优化,确定了最适合乳酸菌蛋白酶提取纯化的方法和条件。乳酸菌细胞经溶菌酶处理获得胞外蛋白酶,再经超滤浓缩获得粗酶液,依次进行DEAE弱阴离子交换层析和Hi Trap Butyl弱疏水层析。最终得到电泳纯的保加利亚乳杆菌CH9-3 4.0、SH3 4.3和SB5蛋白酶,其分子量分别为39、40和52 k Da,得率分别为46.6%、39.3%和40.4%,分别被纯化了42.8、32.6和31.9倍,纯化后各菌株蛋白酶的比酶活分别为54.4,80.3和61.1 U/mg。研究上述3株保加利亚乳杆菌纯化蛋白酶的酶学性质,结果表明,这3株乳酸菌纯化蛋白酶的最适反应温度均为42℃,在4~50℃比较稳定;最适反应p H均为6.0左右,在p H 5.5~7.0比较稳定;Ba2+、Zn2+、Mn2+、Sn2+、Fe3+等离子明显抑制蛋白酶活力,Fe2+离子显著增加蛋白酶活力,EDTA和PMSF明显抑制酶活力,说明这3株保加利亚乳杆菌蛋白酶是金属离子蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。将纯化获得的保加利亚乳杆菌蛋白酶以活力20 U/g蛋白质添加到发酵乳中,利用激光共聚焦、荧光染色、纳米激光粒度分析等技术,研究其对发酵乳凝胶质量的影响,结果证实乳酸菌蛋白酶组分可以显著(P0.05)提高发酵乳凝胶的凝胶硬度、稠度以及表观黏度。保加利亚乳杆菌蛋白酶处理能够明显增加发酵乳凝胶样品聚集体粒径D(4,3)和D(3,2);显著(P0.05)降低发酵乳凝胶样品蛋白质表面负电荷,促进表面电荷达到静电平衡;蛋白酶的水解作用显著(P0.05)增加游离Ca2+含量,而显著(P0.05)减少凝胶结构中酪蛋白结合的Ca2+含量;乳酸菌蛋白酶作用后的发酵乳样品孔洞小、凝胶结构均匀细腻、连接紧密;保加利亚乳杆菌蛋白酶对乳蛋白凝乳作用不同,SH3 4.3蛋白酶作用增加样品凝胶的黏度和剪切应力;CH9-3 4.0蛋白酶作用增加样品凝胶结构的强度和弹性模量G′。
【关键词】：乳酸菌 蛋白酶 酶学性质 凝乳 发酵乳品质
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS252.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-16
• 第1章 绪论16-35
• 1.1 课题背景及研究目的和意义16-17
• 1.2 乳酸菌蛋白酶研究进展17-26
• 1.2.1 乳酸菌的蛋白质代谢17-18
• 1.2.2 乳酸菌蛋白水解系统18-19
• 1.2.3 酪蛋白的降解19-24
• 1.2.4 乳酸菌蛋白酶性质24-26
• 1.3 酸乳凝胶研究进展26-32
• 1.3.1 酸凝乳的形成26-27
• 1.3.2 粒子凝胶模型27-28
• 1.3.3 酸凝乳机制研究28-31
• 1.3.4 影响酸奶凝胶结构的因素31-32
• 1.4 乳酸菌蛋白酶影响乳品质量研究进展32-34
• 1.4.1 乳酸菌蛋白酶对乳制品加工的影响32-33
• 1.4.2 蛋白水解对凝胶质量的影响研究33-34
• 1.5 课题来源及主要研究内容34-35
• 第2章 实验材料与方法35-52
• 2.1 实验材料35-39
• 2.1.1 主要试剂35-37
• 2.1.2 主要仪器和设备37-38
• 2.1.3 培养基38
• 2.1.4 菌株来源38-39
• 2.2 测定方法39-45
• 2.2.1 OPA法测定蛋白水解度39-40
• 2.2.2 发酵乳质构的测定40
• 2.2.3 发酵乳表观黏度的测定40
• 2.2.4 聚集体粒子大小的测定40-41
• 2.2.5 SDS-PAGE电泳41-42
• 2.2.6 菌株鉴定42-43
• 2.2.7 细菌活菌数的测定43
• 2.2.8 蛋白酶活力测定43
• 2.2.9 凝胶收缩系数43
• 2.2.10 持水力测定43
• 2.2.11 Zeta电位的测定43-44
• 2.2.12 Ca~(2+)含量的测定44
• 2.2.13 酪蛋白结构观察44
• 2.2.14 乳凝胶流变学性质分析44-45
• 2.3 实验方法45-51
• 2.3.1 合成蛋白酶菌株的筛选45-46
• 2.3.2 促进凝乳质量蛋白酶乳酸菌的筛选及鉴定46
• 2.3.3 蛋白酶的分离46-48
• 2.3.4 蛋白酶酶学性质研究48-49
• 2.3.5 蛋白酶影响凝乳品质研究49-51
• 2.4 数据处理与统计分析51-52
• 第3章 促进凝乳质量蛋白酶乳酸菌的筛选52-71
• 3.1 引言52-53
• 3.2 合成蛋白酶菌株的筛选53-55
• 3.3 筛选菌株发酵性分析55-58
• 3.3.1 筛选菌株发酵乳质构55-57
• 3.3.2 筛选菌株发酵乳表观黏度57
• 3.3.3 筛选菌株发酵乳粒度57-58
• 3.4 筛选菌株蛋白酶的活力分析58-63
• 3.4.1 菌株蛋白水解力的比较58-60
• 3.4.2 菌株蛋白酶活力60-61
• 3.4.3 乳蛋白降解SDS-PAGE分析61-63
• 3.5 促进GDL酸化乳凝胶质量蛋白酶乳酸菌的筛选63-68
• 3.5.1 GDL酸化曲线63-64
• 3.5.2 GDL浓度对乳凝胶强度的影响64
• 3.5.3 对乳凝胶质量有促进作用蛋白酶乳酸菌的筛选64-68
• 3.5.4 促进凝乳蛋白酶菌株的选择68
• 3.6 筛选菌株的鉴定68-70
• 3.6.1 筛选菌株形态学特性68-69
• 3.6.2 菌株鉴定69-70
• 3.7 本章小结70-71
• 第4章 乳酸菌蛋白酶的纯化及性质研究71-94
• 4.1 引言71-72
• 4.2 筛选菌株蛋白酶的提取纯化72-86
• 4.2.1 粗酶液的浓缩72-73
• 4.2.2 阴离子交换层析参数优化73-77
• 4.2.3 离子交换层析结果77-78
• 4.2.4 凝胶层析78-79
• 4.2.5 疏水层析参数优化79-83
• 4.2.6 疏水层析结果83-86
• 4.3 酶学性质研究86-92
• 4.3.1 酶动力学参数测定86-87
• 4.3.2 最适反应温度87-88
• 4.3.3 热变性温度88-89
• 4.3.4 温度稳定范围89
• 4.3.5 最适反应p H89-90
• 4.3.6 p H稳定范围90-91
• 4.3.7 金属离子对酶活力的影响91-92
• 4.4 本章小结92-94
• 第5章 乳酸菌蛋白酶影响凝乳品质研究94-113
• 5.1 引言94
• 5.2 蛋白酶对凝胶蛋白水解度的影响94-96
• 5.3 各菌株蛋白酶组分对凝胶品质的影响96-100
• 5.3.1 对凝胶质构的影响97-98
• 5.3.2 对凝胶表观黏度的影响98-99
• 5.3.3 对凝胶脱水敏感性的影响99-100
• 5.4 蛋白酶对凝胶理化性质的影响100-105
• 5.4.1 对凝胶粒径分布的影响100-102
• 5.4.2 对凝胶zeta电位的影响102-103
• 5.4.3 蛋白酶对Ca~(2+)含量的影响103-105
• 5.5 蛋白酶对乳蛋白降解的影响105-106
• 5.6 蛋白酶对酪蛋白结构的影响106-108
• 5.7 蛋白酶对乳凝胶流变性的影响108-111
• 5.8 本章小结111-113
• 结论113-115
• 参考文献115-130
• 附录 一130-131
• 附录 二131-132
• 附录 三132-140
• 附录 四140-141
• 攻读博士学位期间发表的学术论文141-143
• 致谢143-144
• 个人简历144

，

本文编号：1083492