重组水蛭素的聚乙二醇修饰及其反应动力学

发布时间：2017-11-14 18:33

  本文关键词：重组水蛭素的聚乙二醇修饰及其反应动力学

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【摘要】：药用蛋白质具有活性高、特异性强、生物功能明确等优点,已成为生物医药产业发展的热点,但临床上仍存在半衰期短、免疫原性强、稳定性差等缺陷。因此研发长效剂型成为新的发展趋势,其中聚乙二醇(PEG)修饰是研发长效药用蛋白质最为成功的方法。聚乙二醇修饰具有延长药用蛋白质在体内的半衰期、降低免疫原性和延缓蛋白酶降解、提高稳定性和溶解性等优点。然而,PEG修饰药用蛋白质仍然面临降低修饰剂损失、控制修饰位点和修饰度等难题。为解决上述问题,以重组水蛭素作为模型药用蛋白质,建立了PEG修饰重组水蛭素的反应动力学模型,考察了体系的溶剂环境、离子交换柱原位修饰和不同PEG修饰剂的影响。主要研究结果如下：(1)建立了PEG修饰重组水蛭素的反应动力学模型,并将其应用于修饰反应的条件优化,获得了几个关键参数(ymax、mcrit和tmax)的通用表达式,确定了影响单修饰产物得率的关键因素。结果表明,所构建的反应动力学模型不仅能解释PEG修饰重组水蛭素的反应机理,而且能用于PEG修饰蛋白质过程的优化控制。(2)考察了水-有机溶剂混合溶液对PEG修饰重组水蛭素的影响。通过对重组水蛭素的结构、PEG修饰剂的水解动力学和修饰反应动力学的分析表明,水-有机溶剂混合溶液能通过溶剂化效应(PEG修饰加速和PEG水解抑制)提高PEG修饰的效率。根据占主导的溶剂化效应,可将水-有机溶剂混合溶液反应体系分为三种类型：PEG修饰加速驱动型、PEG水解抑制驱动型、PEG修饰加速与PEG水解抑制共同驱动型。用水-二甲基亚砜混合溶液获得理想得率(约50%)的单修饰产物时,PEG修饰剂用量比纯水溶液降低3-5倍。(3)建立了离子交换柱原位修饰重组水蛭素的工艺,使PEG修饰与产物分离纯化在同一个单元操作中完成,实现反应与分离的过程集成。考察了不同离子交换树脂介质对原位修饰的影响,结果表明树脂的孔径和内部表面结构(如结合高分子的葡聚糖)对PEG修饰的影响较大。考察了不同PEG分子量对原位修饰的影响,结果表明离子交换柱原位修饰(固相修饰)是扩散控制的过程,其单修饰产物的理论得率随PEG分子量增大而降低,这与液相修饰正好相反。单修饰产物的体外、体内活性分析表明,离子交换柱原位修饰能提高PEG修饰的选择性,其单修饰产物的体外和体内抗凝活性比液相修饰更高。(4)采用分枝型mPEG2-NHS制备高得率、高活性保留率的单修饰产物。PEG修饰剂的水解动力学和修饰反应动力学表明,分枝型mPEG2-NHS修饰重组水蛭素的反应速度比直线型mPEG-SC稍慢,而其自身失活速度却比mPEG-SC快的多,获得理想得率的单修饰产物的PEG修饰剂用量更大。单修饰产物的体外、体内活性分析表明,分枝型mPEG2-NHS比线型mPEG-SC更容易保护重组水蛭素的活性位点不被修饰,获得的单修饰产物体外抗凝活性更高,体内的药效更强。(5)应用响应面分析法优化了mPEG-ALD定点修饰重组水蛭素N末端的反应条件。结果表明,mPEG-ALD定点修饰比nPEG-SC随机修饰重组水蛭素得到的单修饰产物的修饰位点更均一,理论得率更高。定点修饰得到的单修饰产物仍能保留重组水蛭素20%左右的体外抗凝活性。综上所述,以PEG修饰药用蛋白质反应动力学模型为基础,通过系统研究微环境因子对PEG修饰药用蛋白质的影响,能减少PEG修饰剂的用量并有效控制药用蛋白的PEG修饰位点和修饰度,为高效制备PEG修饰药用蛋白质提供了新的思路。
【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.1
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本文编号：1186572