产絮菌Agrobacterium tumefaciens F2利用混合碳源半连续发酵制备生物絮凝剂

发布时间：2017-11-25 06:12

  本文关键词：产絮菌Agrobacterium tumefaciens F2利用混合碳源半连续发酵制备生物絮凝剂

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【摘要】：生物絮凝剂是近年来备受关注的一种无毒害、无二次污染及可生物降解的绿色净水剂,潜在的环境效益使其在水处理领域具有广阔的应用前景。目前生物絮凝剂工业化生产面临的主要问题是产量偏低及发酵方式单一。基于此,本研究以生物絮凝剂产生菌Agrobacterium tumefaciens F2为研究对象,分析菌株生理水平对单糖的跨膜传输及磷酸化反应特性,构建葡萄糖、半乳糖、甘露糖混合碳源的产量预测模型,选取菌丝球为生物质载体固定化产絮菌株F2开发新型发酵方法。首先考察了产絮菌株Agrobacterium tumefaciens F2以葡萄糖、半乳糖、甘露糖为单一碳源时的跨膜传输特性及磷酸化反应速率。采用高效液相色谱法定量检测单糖,依据细胞反应动力学、酶促反应米氏方程、渗透系数等基本理论,考察不同初始浓度对菌株生理水平跨膜及磷酸化反应速率的影响。结果表明,在25 mmol/L-150 mmol/L浓度范围内,100 mmol/L的跨膜传输速率最佳,发酵至18 h达到最大值,单糖跨膜传输的制约因素是细胞膜载体蛋白的结合能力及胞外底物浓度;三种单糖初始浓度在10-30 mmol/L条件下,半乳糖磷酸化反应速率低于葡萄糖和甘露糖的数值,证明产絮菌株F2细胞中的半乳糖激酶活性低于己糖激酶;渗透系数随初始底物浓度增加逐渐降低,24 h达到最大值,与各单糖跨膜传输速率是相辅相成、相互制约的整体。通过产絮菌株F2利用单一碳源葡萄糖、半乳糖、甘露糖及三种单糖的混合碳源的生长动力学分析,明确三种单糖混合发酵的最佳初始浓度为9 g/L,配比为5:1:3。采用BP神经网络构建三种单糖初始浓度对应絮凝效能、絮凝剂产量的预测模型,优化所得最优解分别是葡萄糖6.59 g/L、半乳糖1.32 g/L、甘露糖3.57 g/L,预测絮凝效能及产量最大值为96.91%和2.93 g/L,显著高于单一碳源发酵的产量(1.78 g/L);经柱前衍生化方法测定三种单糖混合发酵时的利用规律,结合生长曲线可知,在对数期前期,葡萄糖为菌株的主要产能碳源,在对数期后期(14-18 h)及稳定期前期(18-26 h)三种单糖直接合成大量絮凝剂,24 h产量达最大值(2.93 g/L),这是由产絮菌株F2对单糖的跨膜传输及磷酸化反应特性决定的。计算产絮过程的碳源转化率,混合碳源发酵的菌体生物量及多糖类聚合物分别是21%和33%,远高于葡萄糖、半乳糖、甘露糖单一碳源发酵时的转化率(菌体转化率约10%,絮凝剂转化率20%左右)。全部结果证明混合碳源发酵可促进菌株合成絮凝剂的产量及碳源转化率提高。以黑曲霉Aspergillus nige Y3菌丝球作为载体,实现了产絮菌株F2的固定化及半连续发酵制备生物絮凝剂。菌丝球载体在产絮菌培养基中生长良好,通过吸附法可成功固定化产絮菌株F2,经连续转接后球体形态稳定,且附着的细菌生物量逐渐增多,归功于产絮菌分泌的多糖絮凝剂,单批次发酵的吸附量约为8.75×109 cfu/g菌丝球干重。采用响应面分析法优化固定化发酵的培养条件,最优结果是接种量8%,发酵时间27 h,经验证可得3.24 g/L的絮凝剂,相较于游离发酵的产量(2.93 g/L)提高了近10%。进一步优化了絮凝剂干粉的絮凝条件,预测最佳结果是干粉投加量0.03 g/L,Ca Cl2投加量1 m L/L,环境p H=8,絮凝效能可达97.98%,经反复验证证明两个模型具有较高的精准度。分析了固定化发酵单周期的产絮效能,菌体生长周期与游离发酵基本保持一致,26 h可收获最大产量(3.35 g/L)。将固定化产絮菌的菌丝球连续传代培养,结果证实至少可转接30个周期(24 h/周期),并可同时保证菌体生物量、絮凝效能及絮凝剂产量三者的稳定性。综上所述,为促进产絮菌株F2的产量提高及开发新型发酵方法,本研究围绕菌株对葡萄糖、半乳糖、甘露糖的利用规律,构建葡萄糖、半乳糖、甘露糖三者混合使用时的产量预测模型,并以菌丝球为生物质载体实现了固定化产絮菌株F2的半连续发酵。意义在于提高了产絮菌株F2的碳源转化率及絮凝剂产量,为混合碳源制备生物絮凝剂奠定基础;半连续发酵方法可有效保证发酵系统的菌体生物量、增强菌体抗性、免除种子液制备及接种步骤,菌丝球生物质载体的选用便于后续固液分离及载体处理。研究结果表明,产絮菌株F2利用混合碳源的半连续发酵可促进产量提高,并为工业化发酵方式提供了新思路。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X703.5;X172

【参考文献】

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本文编号：1225041