重组大肠杆菌全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯丙酮酸的研究

发布时间：2017-12-05 18:14

  本文关键词：重组大肠杆菌全细胞转化L-苯丙氨酸合成苯丙酮酸的研究

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【摘要】：α-苯丙酮酸(PPA)是一种多功能有机酸,广泛应用于制药、食品、化学工业。传统的化学制备法环境污染严重,微生物发酵法产量低。对于生物转化法,一般采用D-氨基酸氧化酶(D-AAO)催化D-苯丙氨酸合成PPA,反应过程中生成毒性副产物过氧化氢。来自Proteus.sp的L-氨基酸脱氨酶(L-AADs)可特异性催化L-苯丙氨酸(PLA)氧化脱氨基合成PPA,不生成过氧化氢且PLA比D-苯丙氨酸价格便宜。本论文中,在Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达了来自Proteus mirabilis KCTC 2566的膜结合L-氨基酸脱氨酶(L-AAD),构建的重组菌株生长态和静止态两阶段全细胞转化PLA合成PPA。主要结果如下:(1)在E.coli BL21(DE3)中过量表达来自Proteus mirabilis KCTC 2566的L-AAD,对诱导条件进行了优化,提高了L-AAD表达量。对L-AAD纯化步骤(去垢剂种类、是否超高速离心、缓冲液成分)进行了优化,最终L-AAD纯化了52倍,整体得率13%,比酶活0.94±0.01μmol PPA·min~(-1)·mg蛋白~(-1)。然后利用纯酶L-AAD一步法转化PLA合成PPA,并对转化条件进行了优化。最优纯酶转化条件(0.2 mg·m L~(-1) L-AAD,3.0g·L~(-1) PLA,5 mmol·L~(-1) FAD,p H 7.4,35°C)下,转化2.5 h,PPA产量为2.6±0.1g·L~(-1),转化率为86.7%,合成效率为1.0 g·L~(-1)·h~(-1)。(2)通过两阶段全细胞转化(生长态细胞转化和静止态细胞转化),利用重组E.coli转化PLA合成PPA。首先,对摇瓶生长态细胞转化条件进行了优化(PLA浓度10g·L~(-1),温度35°C),并建立了两阶段温度控制策略(即前12 h,20°C低温诱导,然后向系统中添加PLA,并提高温度至35°C,直到反应结束),转化16 h,PPA产量为7.2±0.4 g·L~(-1),PLA转化率为72.0%。然后对静止态细胞转化条件进行了优化(4 g·L~(-1)PLA,1.2 g·L~(-1)细胞催化剂,p H 7.4,40°C),转化6 h,PPA产量为3.3±0.2 g·L~(-1),PLA转化率为82.5%。分别从PPA产量、底物转化率、合成效率、稳定性、是否需要外加辅酶、可重复使用性这些方面,比较了酶转化和全细胞转化。(3)对3 L罐上两阶段全细胞转化条件进行了优化。生长态细胞转化最优PLA浓度为30 g·L~(-1),反应6 h,达到最大PPA产量21.5±1.3 g·L~(-1),底物转化率71.7%。然后对静止态细胞转化条件进行了优化(搅拌转速500 rpm,通气量1.5 vvm,PLA浓度15 g·L~(-1)),3 h内底物转化率100%。结合影响罐上静止态细胞转化过程的三个主要因素(细胞失活、底物抑制、产物抑制),构建了静止态细胞转化的动力学模型。经过验证,模型能够较精确地预测实验结果。(4)针对全细胞催化剂的副反应及L-AAD活性低的问题,结合PPA降解途径改造和L-AAD分子改造,提高了全细胞催化能力和PPA产量。首先,敲除了三种催化PPA降解的氨基酸转氨酶,静止态细胞转化PPA产量从3.3±0.2 g·L~(-1)提高到3.9±0.1g·L~(-1),底物转化率达到97.5%。然后通过易错PCR结合定点饱和突变提高全细胞催化性能。三点突变体D165K/F263M/L336M有最高的静止态细胞转化PPA产量10.0±0.4g·L~(-1),底物转化率为100%,是野生型的3倍。改造菌株摇瓶生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为19.8±2.3 g·L~(-1)和10.0±0.2 g·L~(-1);3 L罐上生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为45.1±2.1 g·L~(-1)和30.0±1.2 g·L~(-1)。(5)通过代谢改造加强E.coli FAD合成和再生系统提高全细胞活性。首先,向培养基中额外添加FAD,PPA产量提高,证明辅酶浓度是L-AAD催化的限制性步骤。然后过量表达和微调FAD合成途径关键基因(rib H、rib C、rib F),提高转化初始胞内FAD浓度,静止态细胞转化PPA产量提高了90%(19.4±1.1 g·L~(-1))。然后构建了FADH2/FAD再生系统,表达了甲酸脱氢酶和NADH氧化酶,加强了FADH2/FAD再生速率。重组菌株摇瓶生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为57.1±2.3 g·L~(-1)和34.4±1.1 g·L~(-1);3 L罐上生长态和静止态细胞转化PPA产量分别为75.3±4.3 g·L~(-1)和58.4±3.2 g·L~(-1)。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ921

【参考文献】

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1 陈e，

本文编号：1255724