基于生物传感器的革兰氏阴性菌非靶向筛查技术研究

发布时间：2017-12-09 09:32

  本文关键词：基于生物传感器的革兰氏阴性菌非靶向筛查技术研究

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【摘要】：目前,食品安全已成为全球性问题,恶性食品污染事件频繁爆发。随着食品加工技术的日新月异,带来的食品安全隐患不容忽视。由此造成的食源性疾病更成为影响公众健康的重要因素。据报道,约有三分之二的食源性疾病是由细菌引起的。传统的细菌检测方法有:培养和菌落计数法,基于免疫学的方法以及PCR方法。这些方法是依赖于特异性的微生物和生化鉴定,因此只能实现对已知菌的定向检测。细菌种类繁多,传统检测方法的局限性造成对未知菌较高的漏检率,使得检测结果的可靠性受到一定程度的质疑。因此亟需建立一种能够高效快速准确检测食品中未知细菌的方法,实现快速筛查及毒力评价的技术。而生物传感技术拥有较高的灵敏度和较强的特异性,特别是细胞传感技术以活细胞作为识别元件,可以模拟体内的真实反应,已经在医疗诊断、药物筛选、环境监督等领域有广泛应用。因此本研究以革兰氏阴性菌作为研究对象,以LPS信号转导机制和AHL分子印迹识别为理论依据,通过将电化学检测、重组蛋白制备、磁性分子印迹以及荧光报告基因转染等手段相结合构建一系列新型灵敏的革兰氏阴性菌非靶向筛查的传感新方法与新技术,为食品安全检测与评价研究提供了一条崭新的途径。为探索电化学细胞传感法应用于检测革兰氏阴性菌LPS激活RAW264.7细胞释放NO的过程。采用电沉积法在金电极表面修饰铂纳米粒子,创新性的结合新型高分子碳纳米材料氧化石墨烯,制备具有良好生物相容性和机械强度良好的海藻酸钠/氧化石墨烯凝胶,将RAW264.7细胞固定在已修饰的电极表面形成细胞3D培养系统。以RAW264.7细胞为识别元件构建细胞电化学传感器,通过对LPS的高灵敏检测,实现对革兰氏阴性菌的间接检测。该传感器在10-2 ng/m L到1 ng/m L浓度范围内,LPS浓度与峰电流值呈良好的线性关系,线性方程为y=9.035x+53.578,R2=0.9842;在1 ng/m L到10 ng/mL浓度范围内,LPS浓度与峰电流值呈良好的线性关系,线性方程为y=0.4778x+53.756,R2=0.9941;在10 ng/mL到104 ng/m L浓度范围内,LPS浓度与峰电流值呈良好的线性关系,线性方程为y=10.019x+50.3,R2=0.9732。LPS的最低检测限为8 pg/mL。验证了该3D细胞电化学传感器用于检测革兰氏阴性菌LPS的可行性,实现了对革兰氏阴性菌这一类菌的间接检测。为了满足对革兰氏阴性菌快速、灵敏、主动的直接检测的需求。利用RBL-2H3细胞表面的大量天然高亲和力IgE受体(FcεRI),结合通过重组蛋白技术人工合成的毒力因子受体CD14-Fcε嵌合蛋白,创新性的将荧光检测技术通过基因编码钙离子指示剂GCaMPs与生物离子传感串联运用到革兰氏阴性菌及LPS刺激IgE介导RBL-2H3细胞中钙离子信号转导的检测中。该传感器在101 CFU/m L~103 CFU/m L的浓度范围内,随着大肠杆菌ATCC 25922浓度的增加,细胞传感器的相对荧光强度不断增大,线性方程为y=1.4081x+0.0332,R2=0.9728。大肠杆菌ATCC 25922的检测限为102 CFU/m L。选用猪肉作为食品样品用于实际样品中革兰氏阴性菌的检测。同空白对照组比较,浓度为102 CFU/mL的大肠杆菌ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、痢疾志贺氏菌ATCC 3313刺激荧光RBL-2H3细胞传感器产生的相对荧光强度均有显著性的增加。以上结果充分证明了该细胞传感器用于革兰氏阴性菌这一类细菌直接检测的可行性,并且检测时间短。为了进一步实现对革兰氏阴性腐败菌的检测,通过溶剂热法合成了Fe3O4磁珠,创新性的以革兰氏阴性菌群体感应信号分子类似物(呋喃酮)为模板分子,将Fe3O4 MNPs作为内核,SiO2作为外壳,氨基化该核壳型磁球,并在其表面聚合,制备分子印迹聚合物微球Fe3O4@SiO2-MIP。通过磁吸附作用,实现磁性分子印迹聚合物在磁性电极表面的固定,得到检测革兰氏阴性菌群体感应信号分子的磁性分子印迹电化学传感器。采用磁性电极吸附Fe3O4@SiO2-MIP并进行电化学分析,DMHF浓度在2.5×10-9~1.0×10-7mol/L范围内与电流存在良好的线性关系(R2=0.9915),线性方程为y=-0.3095x+90.967,检测限为8×10-10 mol/L。研究了7种细菌上清液,在大肠杆菌O157:H7,鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028或金黄色葡萄球菌ATCC 29213的上清液中没有检测到AHL,此结果与这些菌不产生AHL的特性相一致。说明该法测定AHL的可行性和特异性。分别对嗜水气单胞菌无菌上清液和铜绿假单胞菌无菌上清液中群体感应信号分子进行检测,回收率在96.1%~103.4%范围内,满足检测要求。RSD值小于2.72%,在误差允许的范围内,说明该法测定AHL的数据可信。验证了该磁性分子印迹电化学传感器用于革兰氏阴性腐败菌间接检测的可行性。仅仅完成对未知细菌的检测还是远远不够的,识别其毒力的大小才是最终目的。创新性的在NF-kB识别元件后连接一段荧光蛋白基因(mCherry)构建融合质粒,通过脂质体转染将pGL4.26-mcherry-NF-κB质粒导入293/hTLR4A-MD2-CD14细胞中,构建能表达红色荧光的293/hTLR4A-MD2-CD14细胞传感器。采用热酚水法提取14种革兰氏阴性菌的LPS,进行SDS-PAGE银染分析,并用其刺激所构建的敏感细胞模型,对所诱导的荧光和炎症因子分泌的情况进行比较分析。以20 h为刺激的时间终点,随着LPS浓度的增加,大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、阪崎肠杆菌、痢疾志贺氏菌和铜绿假单胞菌LPS刺激组的荧光强度逐渐增加,TNF-α和IL-8的分泌量也逐渐增加。在同样浓度的LPS刺激下,铜绿假单胞菌(假单胞菌科)LPS刺激组的荧光强度明显低于其他细菌(肠杆菌科)LPS刺激组,这与铜绿假单胞菌五酰基化的Lipid A结构有关。验证了该细胞传感器评价革兰氏阴性菌LPS毒力大小的可行性。肠道上皮细胞是粘膜表面对细菌入侵的最早的传感器,因此研究肠道细胞对LPS的反应非常有意义。以蛋白免疫印迹、流式细胞术、RT-PCR等为技术手段,以检测蛋白表达及炎症因子表达为客观指标,首先研究了三种人肠道上皮细胞Caco-2,HT29,SW480 TLR4的表达的情况,以及肠道上皮细胞对LPS的反应。随后将肠道上皮细胞Caco-2,HT29,SW480分别与巨噬细胞THP-1共培养,模拟机体内肠道上皮细胞与固有层MΦ的“对话”,创新性的研究了LPS刺激共培养体系下,肠道上皮细胞TLR4的表达情况,以及肠道上皮细胞对LPS的反应。结果表明,在单独培养条件下,Caco-2细胞不表达TLR4,HT29细胞细胞质内表达TLR4,SW480细胞细胞表面表达TLR4。LPS刺激24 h后,Caco-2,HT29,SW480细胞TLR4的表达均不增加。Caco-2和HT29细胞对LPS无反应,SW480细胞对LPS有反应。在LPS刺激24 h共培养体系下,HT29和SW480细胞的TLR4表达均无显著性增加,而Caco-2细胞的TLR4表达显著性增加。HT29细胞对LPS无反应,SW480细胞和Caco-2细胞对LPS有反应。因此,SW480细胞是LPS刺激的敏感肠道细胞模型。探索了LPS刺激肠道细胞的反应机制,为筛选出LPS刺激的敏感肠道细胞模型提供理论基础,为下一步构建肠道共培养模型提供新的思路。综上,本论文主要围绕生物传感技术在革兰氏阴性菌非靶向筛查中的应用进行研究。以革兰氏阴性菌为检测对象,结合电化学检测、重组蛋白制备、荧光报告基因转染以及磁性分子印迹等技术构建了一系列新型、主动、真实的生物传感检测评价方法,并用于实际样品检测中,为生物传感识别水平的提高和食品安全检测评价技术的发展提供了有力的保障和支持。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TP212.3;TS207.4

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1 蒋卉;基于生物传感器的革兰氏阴性菌非靶向筛查技术研究[D];江南大学;2017年

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