乳及乳制品中主要食源性致病菌的免疫快速检测方法研究

发布时间：2017-12-16 19:09

  本文关键词：乳及乳制品中主要食源性致病菌的免疫快速检测方法研究

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【摘要】：鲜乳及其生产过程中食源性致病菌的污染是乳制品安全的主要威胁之一。传统的培养方法虽然准确,但耗时较长、步骤繁多、检测效率低,食品企业和基层检验机构亟需一种准确、简便、快速、成本低的分析手段来监测原料、生产过程及最终产品中的致病微生物。本文调查了乳及乳制品中主要的食源性致病菌,以大肠杆菌O157:H7、金黄色葡萄球菌5种主要肠毒素、沙门氏菌、单增李斯特菌作为研究对象,并根据不同细菌的特点筛选、制备免疫原,来筛选特异性好、交叉均一的单克隆抗体,并基于配对抗体建立了准确、简便、快速、低成本的免疫分析方法,应用于乳品中的快速检测。首先,为建立大肠杆菌O157:H7特异型的免疫分析方法,采用煮沸灭活的大肠杆菌O157:H7为免疫原免疫小鼠,经过细胞融合、筛选,制备了特异性识别大肠杆菌O157:H7的单克隆抗体,通过两两配对获得了配对抗体并建立了大肠杆菌O157:H7特异型的ELISA和胶体金试纸条方法,检测限(P/N≥2.1)分别为1.1×105 CFU/m L和3×105 CFU/m L,与其它常见细菌无交叉反应。同时,用western blot研究发现配对抗体识别的抗原位点均为分子量为37 k Da的大肠杆菌O157:H7膜蛋白。第二,为建立金黄色葡萄球菌5种主要肠毒素(SEA,SEB,SEC,SED,SEE)的免疫分析方法,分别采用5种重组表达的肠毒素为免疫原制备了单克隆抗体,并通过配对和筛选获得了5种肠毒素的最优配对抗体,分别建立了相应的ELISA和胶体金试纸条方法。5种肠毒素ELISA方法的实际检测限分别为0.15、0.08、0.14、0.12、0.25μg/kg。并进一步开发了可以同时检测5种肠毒素的多重胶体金试纸条方法,应用于乳品中金葡肠毒素的检测。第三,为建立沙门氏菌属的免疫分析方法,首先制备了鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白和脂多糖LPS的单克隆抗体,发现脂多糖单抗配对检测鼠伤寒沙门氏菌的灵敏度较好,建立的ELISA和胶体金试纸条方法的检测限分别为104 CFU/m L和1.3×105 CFU/m L,与O抗原相同的乙型副伤寒沙门有交叉反应,与其它沙门氏菌无交叉反应。同时采用NaIO4和EDC法合成了沙门氏菌脂多糖的完全抗原用于免疫小鼠,制备了沙门氏菌属特异性的LPS单抗,基于配对抗体建立了沙门氏菌属ELISA方法,对12株不同O抗原的沙门氏菌的检测限为1.3×105-1.2×106 CFU/m L。基于属特异性LPS单抗5H12和Na IO4合成的LPS包被原,开发了一种基于竞争反应的沙门氏菌属胶体金试纸条方法,可以成功检测到测试的12株沙门氏菌,最低检测限在106 CFU/m L,与其它常见细菌无交叉反应。第四,为建立单增李斯特菌特异性的免疫分析方法,首先,采用P60蛋白为免疫原制备了单克隆抗体,发现这些单抗均一识别李斯特菌属。基于配对抗体,建立了李斯特菌属的ELISA方法和胶体金试纸条方法,对测试的8株单增李斯特菌和4株李斯特菌均可检测,检测限为105-106 CFU/m L,与其它测试细菌无交叉反应。同时,合成了Pep D多肽并用SMCC法与载体蛋白BSA偶联作为免疫原,制备了单增李斯特菌特异性的单克隆抗体,发现PepD多肽单抗可与李斯特菌属单抗配对并建立单增李斯特菌P60特异性的双抗体夹心ELISA方法和胶体金试纸条方法,并成功将8株单增李斯特菌与4株李斯特菌区分出来,并与其它测试细菌无交叉反应。第五,为了对传统的金黄色葡萄球菌肠毒素B双抗体夹心ELISA方法进行增敏,在修饰4-NTP的金纳米粒子表面还原特定厚度的Ag层,合成了具有强拉曼活性的、内部包裹有4-NTP的金银核壳结构的纳米颗粒,表面修饰金葡肠毒素B抗体后,在微孔板上实现了肠毒素B拉曼检测,该方法的最低检测限为1.3 ng/kg,相比传统的双抗体夹心ELISA方法降低了25倍,可以用于牛奶中低含量金黄色葡萄球菌肠毒素B的检测。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS252.7

【参考文献】

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本文编号：1297129