葡萄根系产褪黑素内生细菌的筛选及其合成路径的研究

发布时间：2017-12-24 18:38

  本文关键词：葡萄根系产褪黑素内生细菌的筛选及其合成路径的研究　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：褪黑素(Melatonin,MEL)是一种动植物和单细胞生物中普遍具有的色氨酸衍生物,它拥有独特的抗氧化和生理调节的功能。外源应用MEL能够促进植物种子发芽,根系发育、开花以及果实成熟,同时也能防止叶片衰老,在生物和非生物逆境胁迫下提高植物的耐受能力。前人的研究表明,非生物胁迫能够提高植物内源MEL的合成,这是由于逆境胁迫下植物产生的活性氧类物质(Reactive oxygen species;ROS)激活了植物MEL的生物合成。在自然条件下,陆地植物的根系聚集着丰富的内生微生物,它们能够与宿主植物互相作用,并调节植物的生长和发育。内生菌是植物生长发育的根系有益组分,它们往往具有合成植物激素的能力,并能够改变宿主的内源激素水平;然而,目前还没有证据表明内生菌能够合成MEL,并且凭此能力,影响宿主植物的生理代谢。本研究从不同葡萄品种的根系内分离、鉴定得到多种内生细菌,随后筛选出具有MEL合成能力的菌株。以高产MEL的菌株为材料,研究其对宿主植物逆境胁迫下内源MEL水平和生长发育的影响;通过~(15)N稳定同位素标记技术,探讨内生细菌MEL生物合成路径;采用原核表达和基因敲除手段,验证参与细菌MEL合成的L-苯丙氨酸羟化酶功能。主要研究结果如下:(1)采用传统分离培养的方式并结合16S rDNA测序,从‘赤霞珠’,‘红地球’,‘夏黑’以及中国野生山葡萄‘长白九号’根系中分离内生细菌,并对优势菌进行培养,结合UPLC-MS/MS技术测定菌株MEL的产生能力。结果显示:4个葡萄品种根系中共分离得到内生细菌6个属,15个种;检测到5株细菌具有MEL合成能力,分别为Bacillus amyloliquefaciens SB-9,Bacillus thuringiensis CS-9,Pseudomonas fluorescens RG11,Agrobacterium tumefaciens CS-30和Variovorax soli VA10,MEL合成能力在0.15 7.75ng/1012 cells之间。(2)选取MEL合成能力最强的内生菌解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SB-9和荧光假单胞杆菌(Pseudomonas fluorescens)RG11侵染不同葡萄品种幼苗根系,结果显示,B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11侵染葡萄幼苗显著提高植株的鲜重,叶绿素含量,根长度和侧根数量等生长指标,表现出优良的生长促进作用;此外,在葡萄幼苗经受干旱或者盐胁迫时,B.amyloliquefaciens SB-9和P.fluorescens RG11根系定殖显著提高内源MEL及其前体物的含量,降低葡萄色氨酸脱羧酶基因(VvTDCs)和5-羟色胺N-乙酰转移酶(VvSNAT)的转录水平;同时通过减少根系内丙二醛(MDA)和活性氧的产生,抵御盐和干旱胁迫带来的不利影响。(3)采用~(15)N稳定同位素标记技术,研究产MEL内生细菌P.fluorescens RG11的MEL合成中间代谢产物组成以及合成规律。结果显示,除了~(15)N-色胺以外,菌液中检测到~(15)N-5-羟色氨酸、~(15)N-5-羟色胺、~(15)N-N-乙酰-5-羟色胺以及~(15)N-MEL的产生,表明此菌株MEL的合成途径与动物中相似,MEL合成的第一步反应是~(15)N-L-色氨酸碳骨架被羟化形成5-羟色氨酸,推测细菌苯丙氨酸羟化酶(PAH)可能负责此菌株的色氨酸的羟基化;此外,P.fluorescens RG11的MEL合成能力在生长期前期最高,培养后期急剧下降,推测MEL在细菌中可能是作为生长信号因子或作为保护因子用于清除培养基中的ROS,以促进细菌生长早期的适应性。(4)分析原核细菌苯丙氨酸羟化酶(PAH)与动物氨基酸羟化酶(AAAHs)家族的亲缘关系,同时克隆得到P.fluorescens RG11的PAH编码基因,原核表达得到此菌株的PAH蛋白,通过酶活分析,在体外进一步研究PAH对L-色氨酸的羟化能力,结果显示:P.fluorescens RG11中PAH蛋白与动物AAAHs家族蛋白存在较高的氨基酸序列相似性;体外酶活测试表明,纯化的重组PAH蛋白同时具有L-色氨酸和L-苯丙氨酸羟化酶活性,能够将L-色氨酸羟基化为5-羟基色氨酸,Km和V_(max)值分别为2575μM和0.834μmol 5-羟基色氨酸/min/mg蛋白,然而对L-色氨酸的亲和力和羟化活力明显低于羟化L-苯丙氨酸。(5)通过同源重组技术,将P.fluorescens RG11控制合成PAH蛋白的phhA基因敲除,构建?PhhA敲除菌株,随后采用~(15)N同位素示踪法和UPLC-MS/MS技术,进一步研究细菌PAH蛋白与MEL合成的关系,结果显示:phhA基因敲除显著降低了5-羟色氨酸以及后续代谢产物的产量;?PhhA菌株在整个培养时期没有检测到MEL的产生,表明PAH负责RG11菌株5-羟色氨酸的合成,并在MEL的合成路径中起到重要作用。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS255.1

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本文编号：1329531