混合模式层析和扩张床吸附分离重组人血白蛋白研究

发布时间：2018-01-04 07:24

  本文关键词：混合模式层析和扩张床吸附分离重组人血白蛋白研究　出处：《浙江大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：人血白蛋白(HSA)是人体血浆中最重要的蛋白质之一,广泛应用于多个领域,市场需求巨大。人血浆来源HSA(pHSA)受限于血浆,以及病毒污染等风险,导致货源紧张。基因重组人血白蛋白(rHSA)能避免病毒感染,解决原料紧张等问题,不过分离纯化要求高。常规rHSA分离中常用阳离子交换层析捕获rHSA,料液需要稀释和pH调节,影响分离效率,研发具有高选择性和耐盐特性的新型分离方法将有助于改善rHSA分离工艺。混合模式层析(MMC)和扩张床吸附(EBA)是两种新型的生物分离方法,MMC具有吸附量大、选择性高、耐盐性好、洗脱条件温和等优点,EBA可直接从含有生物质固体颗粒的料液中捕获目的蛋白。本文从新型配基筛选和介质制备出发,探讨MMC和EBA分离rHSA新过程,发挥MMC高效分离和EBA高处理量的优势,形成混合模式扩张床吸附新方法,实现酵母发酵液中分离rHSA。主要研究内容包括:(1)基于色氨酸类似物的混合模式配基筛选。依据HSA可结合色氨酸的特点,筛选色氨酸及其类似物作为配基,制备了 10种混合模式介质,比较了 HSA吸附性能。发现HSA吸附受pH影响显著,最高吸附容量出现在HSA等电点附近,以色胺为配基的TA-B介质饱和吸附容量最高,达143.54 mg/ml。酸性条件下,饱和吸附容量和结合常数下降明显。添加盐后,HSA吸附容量下降,不过TA-B介质在高盐下仍有较高的吸附容量(约95mg/ml)。结果表明,以色胺为配基的TA-B介质对HSA具有较强的亲和力,良好的耐盐特性,且在较宽的pH范围内具有较高的吸附容量。(2)以色胺为配基的混合模式介质制备及吸附性能。以色胺为功能配基,3种琼脂糖微球为基质,优化基质活化和配基偶联过程,制备了系列配基密度的色胺介质。pHSA静态吸附结果显示,配基密度影响蛋白吸附,合适的基质和中等配基密度可以得到较理想的吸附容量。相比于商业化混合模式介质,TA-B-6FF对HSA的吸附容量更高。吸附动力学实验显示,pH 5.0时吸附速率最快,有效孔扩散系数最高,添加盐会减缓蛋白在介质内的扩散速率。蛋白穿透实验表明,TA-B-6FF介质的动态结合能力较强,流速对动态载量影响较小,在700cm/h高流速仍具有较高的动态载量(54.5 mg/ml),适合用于高流速操作。(3)混合模式层析分离重组人血白蛋白。以毕赤酵母发酵液为原料,考察了TA-B-6FF层析分离rHSA。rHSA静态吸附规律与pHSA类似,pH 5.0时吸附最佳,Qm为54.60 mg/ml;在pH 6.0～8.0范围内,变化较小;pH 4.0时,吸附容量显著下降。料液稀释对rHSA吸附影响不大,发酵液可不经过稀释和pH调节直接上样。动态载量随流速增加而逐渐降低,流速为100～300cm/h时,Q10%为19.7～30.3 mg/ml介质,上样量约2.0～3.5 ml发酵液/ml介质。优化分离工艺,采用两步洗脱,rHSA单体收率为98.5%,纯度为87.8%,纯化因子约11,色素和HCP去除率约90%。经20次层析分离验证,过程稳定性良好。(4)混合模式扩张床吸附分离重组人血白蛋白。以石英砂/琼脂糖和碳化钨/琼脂糖复合多孔微球为基质,色胺为配基,制备了混合模式扩张床介质TA-S和TA-T。静态吸附结果表明,pH5.0时HSA吸附最佳,TA-S和TA-T饱和吸附容量分别为164.18 mg/ml和72.06 mg/ml,且具有一定的耐盐吸附特性。固定床模式下,流速对蛋白吸附的影响较大;扩张床模式下,膨胀率越大,蛋白穿透越快,动态载量逐渐下降,最佳膨胀率为1.8,TA-S和TA-T的动态载量分别为27.54 mg/ml和18.04mg/ml介质。酵母发酵液调节pH5.0后直接上样,采用两步洗脱,TA-S介质扩张床吸附分离效果较好,rHSA单体收率和纯度分别为91.6%和83.3%。(5)HSA与色胺介质的相互作用分析。采用分子模拟,通过分子对接确定HSA表面有4个潜在的色胺结合位点,其中一个位于典型的吲哚结合位点。分子动力学模拟结果显示,色胺配基与HSA结合稳定,结合位点周围以疏水氨基酸残基为主,但部分负电或极性残基贡献更大的静电作用能,说明色胺-HSA结合以静电作用为主,氢键和疏水作用为辅。等温滴定量热分析表明,pH4.0～7.0时,色胺介质主要通过静电作用吸附HSA,pH 8.0时HSA结合以疏水作用为主;随NaCl浓度增大,色胺-HSA相互作用由静电为主转变为疏水作用为主。本文围绕rHSA分离,集中于MMC和EBA两种新型生物分离方法,从配基筛选、介质制备和吸附性能出发,通过分离过程优化实现酵母发酵液中高效分离rHSA,形成混合模式层析和扩张床吸附新方法,提高分离效率和过程处理能力,显示出良好的应用潜力。
[Abstract]:Human plasma albumin ( HSA ) is one of the most important proteins in human plasma , which is widely used in many fields . It has the advantages of high adsorption capacity , high selectivity , good salt tolerance and mild elution conditions . The results showed that the dynamic binding capacity of TA - B - 6FF medium was higher than that of the commercial mixed mode medium . The adsorption capacity of the medium was higher than that of the medium . The adsorption capacity of the medium was about 2.0 锝，

本文编号：1377627