食品及饲料中黄曲霉毒素的快速免疫检测试剂盒研究

发布时间：2018-01-04 13:28

  本文关键词：食品及饲料中黄曲霉毒素的快速免疫检测试剂盒研究　出处：《北京科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：黄曲霉毒素是一类由黄曲霉菌和寄生曲霉菌产生的有毒代谢产物,这类毒素毒性大,致癌能力强,理化性质稳定,污染广泛,即使是在现有先进的农业技术和食品加工工艺的条件下,仍然无法完全避免和消除黄曲霉毒素污染。农产品黄曲霉毒素污染已成为严重威胁我国大众健康的重大风险隐患,并且已经给我国经济造成了巨大的损失。因此,研究建立灵敏、准确、快速、便捷的黄曲霉毒素检测产品,为食品安全控制提供关键技术支持,具有广阔的应用前景和重要的现实意义。目前已有的黄曲霉毒素的仪器分析方法专业性要求高、时间长、设备昂贵,严重影响了黄曲霉毒素污染监测工作的开展。酶联免疫试剂盒和免疫检测试纸条由于具有使用方便、不需要昂贵设备、成本低廉的特点而在实际应用中受到广泛欢迎,但是目前现有产品的使用方便性、灵敏度等无法完全满足市场日益严格的要求。随着人们对食品安全要求的日益提高,研发灵敏度高、准确性好、简单易操作的黄曲霉毒素免疫快速检测技术和产品,对于保障农产品和食品安全、促进农业产业发展、破解贸易技术壁垒均具有重要的意义。本研究针对以上问题,研制出了针对黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1, AFB_1)、黄曲霉毒素M_1(Aflatoxin M_1,AFM_1)的单克隆抗体,并以此为基础,建立了针对食品、饲料及乳制品中黄曲霉毒素的快速检测方法,研制了配套的黄曲霉毒素酶联免疫试剂盒和免疫检测试纸条,为黄曲霉毒素污染的监控提供了灵敏、准确、简单、易操作、快速的检测手段。本文的主要研究内容和创新点如下：1.合成了AFB_1-BSA完全抗原,抗原中AFB_1与BSA分子的偶联比为14.5：1。利用抗原研制成功了可分泌抗AFB_1特异性抗体的细胞株2A4。抗体的亲和常数高达7.9×10~9L/mol,并且2A4分泌的是针对AFB_1的特异性抗体,与国内外所报道的抗AFB_1的单克隆抗体进行了比较,该抗体灵敏度高、特异性好。2.通过优化包被缓冲体系、反应pH值、AFB_1单克隆抗体包被浓度等试剂盒参数,研制成功了高灵敏度AFB_1 ELISA检测试剂盒,该试剂盒的最低检测限(IC_(10))为7.6 pg/mL,IC_(50)为66 pg/mL,线性范围为10～810 pg/mL,灵敏度与文献报道相比,具有显著提升。利用试剂盒对多种样品进行了加标回收实验,玉米、豆粕及鱼粉的AFB1添加回收率在108.4%～134.8%之间,批内相对标准偏差≤12.8%,批间相对标准偏差≤11.6%。试剂盒检测结果与HPLC-MS/MS结果相符。该试剂盒可以用于对粮食或饲料样品中黄曲霉毒素B1残留的检测。3.通过优化ELISA的反应模式、抗原抗体用量、样品提取液等试剂盒参数,研制成功了能检测婴幼儿食品中AFB_1的高灵敏度ELISA试剂盒,该试剂盒的最低检测限(IC_(10))为5.5 pg/mL, IC_(50)为24.0 pg/mL,线性范围为5～100 pg/mL。利用该试剂盒对多种婴幼儿辅助性食品进行了加标回收实验,婴幼儿营养米粉、豆粉及豆面的AFB_1添加回收率在84.1%～95.2%之间,批内相对标准偏差≤9.3%,批间相对标准偏差≤7.4%。该试剂盒对实际样品中AFB,的检测能力不仅满足国内限量标准要求,同时也能满足更严格的欧盟限量要求。4.传统植物油中黄曲霉毒素B_1的检测必须经过萃取、净化等样品前处理过程,操作复杂且需要消耗大量有机溶剂。本文建立了一种可直接检测油中AFB_1的“绿色”免疫层析方法。以免疫层析试纸条为基础,按一定比例混合植物油和纯净水,然后用检测卡进行检测,就可以方便的通过肉眼确认油中的AFB_1含量。使用该方法检测植物油中AFB_1的含量,最低检测限可达1.5 μg/kg,并且通过改变水油比就可符合不同的AFB_1限量标准。通过与国家标准方法进行比较,验证了方法的准确性。与此同时,因为方法操作简单,不需要有机溶剂,即使没有经过专业训练的人也能操作。因此,该方法不仅可用于实验室中AFB_1检测也可用于家庭中植物油安全检测,具有广阔的应用前景。5.通过合成AFM_1-BSA完全抗原并免疫小鼠,获得一株可分泌抗AFM_1抗体的细胞株2F12。抗体的亲和常数高达1.8×10~9L/mol,与AFB_1交叉率为40%。通过优化抗体包被浓度、酶标抗原浓度、标准品稀释液等试剂盒参数,研制成功了能同时检测液态奶、酸奶和奶粉中AFM_1和AFB_1总量的ELISA试剂盒,该试剂盒的最低检测限(IC_(10))为37pg/mL,IC_(50)为211 pg/mL,线性范围为50～1500 pg/mL,对AFM_1和AFB_1的交叉反应率分别为100%和102%,对其它黄曲霉毒素的交叉反应率小于20%。利用建立的试剂盒对多种样品进行了加标回收实验,回收率在87.9%～109.1%之间,批内相对标准偏差在3.9%～10.8%之间,批间相对标准偏差≤11.1%。多次对比试验表明,试剂盒的检测结果与进口试剂盒相当。
[Abstract]:This paper has developed a sensitive , accurate , quick and convenient method for the detection of aflatoxin in China , which has a wide application prospect and practical significance . A high sensitivity ELISA kit for detecting aflatoxin B1 in food or feed samples was developed by using the kit . The detection limit of the kit ( IC _ ( 10 )) was 5.5 pg / mL , IC _ ( 50 ) was 24 . 0 pg / mL , the linear range was 10 ~ 810 pg / mL . A new ELISA kit for detecting the total amount of AFM _ 1 and AFB1 in liquid milk , yogurt and milk powder was developed . The results showed that the relative standard deviation was between 3.9 % ~ 109 . 1 % , the relative standard deviation was between 3.9 % ~ 100.8 % , and the relative standard deviation was 鈮，

本文编号：1378721