蜂胶渣抑制桑青枯菌成分咖啡酸酯类化合物的酶促合成与生物活性

发布时间：2018-01-06 19:21

本文关键词：蜂胶渣抑制桑青枯菌成分咖啡酸酯类化合物的酶促合成与生物活性　出处：《江苏科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：桑树青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum,简称青枯菌)引起的一种植物细菌病,具有发病急、蔓延迅速、危害严重、防治困难等特点,属于对蚕业生产毁灭性危害的重要桑树病害之一。当前,桑青枯病的防治措施使用的药剂多为化学农药,毒性较大,污染环境,有的已经禁用,因此急需寻找毒性较小、环境友好和成本可控的新型生物农药制剂。自古以来,蜂胶的抗菌效果得到公认,是蜂巢防病治虫这一天然防御系统的重要组成部分。目前,市场上的蜂胶保健食品常以总黄酮含量作为产品质量评价标准,因而蜂胶制品的工业化生产主要是提取其黄酮类成分,而具有抗菌活性的咖啡酸及其酯类衍生物则残留在大量的蜂胶渣中,若加以利用开发天然来源的农药制剂,则会变废为宝,既节约了成本,又保护了环境,符合国家实施绿色植保战略要求,具有重要的学术意义和经济价值。因此,本课题拟从蜂胶渣中筛选出抑制青枯菌活性强的咖啡酸酯类单体,构建新型双液相酶促合成新工艺,比较分析敏感差异的病原菌全基因组,并探究对桑叶重要害虫及天敌的影响。主要研究内容及结论如下:(1)为寻找蜂胶渣中所含的抑菌活性成分,基于活性追踪法,评价蜂胶渣按照溶剂极性制备的分级提取物对青枯菌五个生理小种的抑制效果,采用液质联用(LC-MS)技术对其含有的咖啡酸及其酯类化合物作定性定量分析,并结合药效进一步筛选出高活性单体化合物。结果表明,蜂胶渣的甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯以及石油醚等提取物对青枯菌的五个小种均有一定的抑菌活性,其中乙醇提取物活性高于其他。0.1 mg/mL的除蜡蜂胶渣乙醇提取物对桑树青枯病病原菌RS-5的抑菌率达91.61±4.75%。对蜂胶渣乙醇提取物应用ESI-LC-MS技术,采用全扫描模式鉴别了咖啡酸及5种咖啡酸酯类化合物,采用选择性反应监测(Selective Reaction Monitor,SRM)模式基于特征离子对测定了咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的含量。从咖啡酸及其6种酯类单体化合物中筛出MC(Methyl caffeate,MC)和咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester,CAPE)两种单体,EC50值分别为310.0-1225.0μg/mL和165.2-752.7μg/m L,对病原菌的细胞产生了变形、破损等严重伤害,对其泳动性和形成生物膜等病原传播特性造成了极大控制,是潜在的桑青枯菌抑制剂,为研发天然来源的桑树青枯病防控药剂提供了新的思路。(2)为提高底物溶解度和合成效率,应用双相催化的原理,通过添加氧膦类络合剂营造可逆的络合萃取效应,首次构建“TOPO-环己烷/[Bmim][Tf_2N]”体系,以强化脂肪酶催化MC与2-苯乙醇发生酯交换合成抑菌活性单体CAPE,解析络合萃取强化酶促反应分离耦合的过程机理,为高效生物合成咖啡酸酯类衍生物提供新工艺;为监测连续流酶催化转酯化合成过程中的底物MC和产物CAPE,实时表征连续流酶催化的反应动力学参数,采用新型离子源的实时直接分析质谱技术(Direct Analysis in Real Time-Mass,DART-MS)建立了一种快速简便的定量新方法。结果表明,三正辛基氧膦(Trioctylphosphine oxide,TOPO)为络合剂,对MC和CAPE等咖啡酸酯类单体具有高选择性的可逆络合反应特性,构建的TOPO-环己烷/[Bmim][Tf_2N](1:1,v/v)双相体系适用于Novozym 435催化酯交换反应合成CAPE。通过响应曲面分析法获得最优工艺条件,即在25 g/L TOPO-环己烷/[Bmim][Tf_2N](1:1,v/v)中,MC浓度为10 g/L、2-苯乙醇与MC的摩尔比为20:1、反应温度为76℃、TOPO浓度为25 g/L、时间为59 h时,MC的转化率为98.83±0.76%,CAPE的得率为96.29±0.07%。其中,最适底物浓度提高了3.33倍;单位底物的催化剂用量减少了77.8%,降低了工艺成本。通过化学计量计算、红外光谱和酶动力学分析,证实TOPO和咖啡酸酯类单体之间的可逆性氢键缔合效应显著增强了反应分离耦合对脂肪酶催化反应的协同作用。选择负离子模式,通过优化DART离子源的操作参数提高了检测灵敏度,获得了高质量的质谱,成功建立了生物催化体系中咖啡酸酯类组分的DART-MS检测新方法,反应物直接检测,无需纯化。使用DART-MS2测定由MC(母离子m/z 192.87和子离子m/z 133.44)和CAPE(母离子m/z 282.93和子离子m/z 178.87)产生的特定离子,根据SRM信号的峰面积,外标法计算标准曲线。在3.125~50 mg/L范围内获得MC和CAPE的线性回归方程,相关系数(R2)分别为0.9515和0.9973,检测限分别为0.005 mg/L和0.003 mg/L,定量限分别为0.02和0.01 mg/L,回收率范围分别为92.50-97.11%和90.11-97.60%。使用DART-MS分析每个样品约40秒,结果与常规高效液相色谱法一致,成功用于测定连续流填充床微反应器中酶反应动力学常数和质量传递系数。因此,双相体系为强化酶促合成CAPE提供了新介质,DART-MS为微流控生物催化动力学表征提供了新手段。(3)为揭示青枯菌2个生理小种(GIM1.71和RS-5)对MC和CAPE的敏感性差异,利用比较基因组学的方法分析两个小种间基因组结构的差异,寻找可能导致耐药性变化的特有基因,或序列结构发生变化的共有基因。采用目前最新的第三代测序技术,对GIM1.71和RS-5进行了全基因组测序,分别获得约3.8M的全基因组序列以及所包含的质粒序列。通过生物信息学方法对基因组中的编码基因、重复序列和非编码RNA进行了全面的注释,共得到约5200编码基因和约70个非编码RNA(包括sRNA和tRNA)。通过与Gene Ontology数据库的比对,对编码基因的功能进行了注释。通过KEGG数据库注释,对编码基因参与的生物学通路进行了分析。通过对GIM1.71、RS-5和已报道GMI1000三个小种的比较,除三者共有的3833个基因外,共找到390个GIM1.71特有的基因和76个RS-5与GMI1000共有而GIM1.71缺失的基因。通过SNP、插入-缺失和基因组结构变异分析,在GIM1.71和RS-5基因组中,识别到了33,697个和44,368个SNP位点;对于三个小种共有基因,识别到了106个基因仅在GIM1.71小种中发生了小片段插入-缺失。这些发现将有助于揭示GIM1.71和RS-5之间对咖啡酸酯类单体敏感性的差异,为进一步的深入分析提供了候选目标。(4)为探究MC对桑叶重要害虫的抑制作用及天敌营养级的影响,评价其作为桑叶害虫新型害虫抑制剂的开发潜能,测定了MC对斜纹夜蛾、桑螟和斑痣悬茧蜂适合度指标的影响。结果表明,1.0%和2.0%的MC对斜纹夜蛾和桑螟幼虫均具有显著的拒食作用,且斜纹夜蛾2龄幼虫对1.0%和0.1%的MC溶液均存在取食选择性。连续饲喂含2.0%MC的桑叶后,斜纹夜蛾幼虫体重增长显著放缓,而取食含1.0%和2.0%的MC的桑叶7 d后,桑螟体重仅为对照组的37.67%和30.00%。随着MC浓度的升高,斜纹夜蛾和桑螟幼虫的存活时间均显著缩短,取食2.0%MC溶液后,两者存活时间分别比对照组缩短了24.6%和57.38%。MC对斜纹夜蛾幼虫化蛹率无显著影响,但在1.0%和2.0%浓度下斜纹夜蛾羽化率显著下降;取食1.0%和2.0%的MC后,桑螟化蛹率分别比对照组下降了60.94%和53.25%,羽化率也随之下降。斑痣悬茧蜂寄生取食不同浓度MC的斜纹夜蛾后,子代寿命、子代体型大小等重要的适合度指标均无显著变化,仅在2.0%浓度处理下出茧数下降、子代蜂发育时间延长。因此,MC在三层营养级关系中,对害虫的抑制作用较大,对寄生性天敌的安全性较高。综上,本文率先对蜂胶渣咖啡酸及其酯类衍生物开展分级提取、酶促合成单体、病原菌基因组比较以及对桑园昆虫及天敌的影响研究,以期为今后研制桑树青枯病新型药剂提供潜在的前体化合物,为蜂胶渣的综合利用拓展新的思路。
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【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ458;S888.7

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