铜绿假单胞菌NY3胞外小分子活性物及其促进烃类降解的作用机制研究

发布时间：2018-01-08 05:01

本文关键词：铜绿假单胞菌NY3胞外小分子活性物及其促进烃类降解的作用机制研究　出处：《西安建筑科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：铜绿假单胞菌属普遍存在于烃类污染环境中,具有优良的石油烃降解能力。铜绿假单胞菌NY3因能快速降解高浓度烃类及其它疏水性有机污染物,而被誉为嗜油菌。前期研究中发现,在某些条件下,尤其是以烃类或其它难降解有机污染物为碳源生长时,NY3菌会分泌丰富的胞外有色物,而伴随着有色物的分泌,需净化的目标污染物的降解率会有明显提高。有关铜绿假单胞菌属降解烃类的酶学研究报道较多,但分泌这些胞外物在该菌降解烃类过程中的作用及其机制报道甚少。本论文关注铜绿假单胞菌NY3在各种生长条件下分泌胞外活性物的性质,并研究胞外活性物助力NY3菌快速利用烃类污染物的特性及其作用机理。本论文以石油烃中的组分为受试污染物,以液液萃取和固相萃取为主要样品预处理方法,以电子自旋共振(EPR)波普、飞行时间质谱(LCMS-IT-TOF)、气相色谱(GC)、扫描电镜(SEM)、紫外光谱(UV)及红外光谱(FTIR)为分析方法,并结合分子生物学研究手段,获得以下研究成果。(1)NY3菌以烃及其转化产物为碳源生长时,可同时分泌绿脓菌素(Pyo)、吩嗪-1-酰胺(PCN)、吩嗪-1-羧酸(PCA)和1-羟基吩嗪(HPE)等四种吩嗪类物质。NY3菌胞外液中吩嗪类物质的总浓度越高,菌体细胞生长量越多,同时胞外液对十六烷的降解率越高。研究发现分泌吩嗪类能促进烃降解的机理是:在胞外,所分泌的四种吩嗪类与NADH或谷胱甘肽(GSH)配合不断释放的羟基自由基对烃类有较高的降解转化效率。补充适量铁离子可使同一胞外反应体系中十六烷降解率提高20-29%。该降解过程是自由基氧化降解机理,反应过程类似于芬顿自由基氧化机理。所不同的是,该反应在中性或弱碱性p H条件下进行。(2)铜绿假单胞菌NY3能于胞外分泌一种淡黄色的具有两种旋光异构的绿脓杆菌螯铁蛋白(PCH)。分泌PCH对烃类污染物降解是“双刃剑”。研究发现胞外适量PCH与Fe螯合能降解烃类物质,且其降解机理是:Fe-PCH是一种产生羟基自由基的催化剂,产生的羟基自由基能以自由基机理降解转化烃类污染物。但分泌过量PCH会抑制NY3菌细胞生长,不利于污染物生物降解。(3)小分子有机酸是NY3菌代谢烃类物质时积累于胞外的转化产物。降解液中十六烷与戊二酸、丁二酸、丙二酸和乙酸等小分子有机酸共存,均可提高NY3菌生长速度和对十六烷的降解率,而共存草酸亦可提高十六烷降解率,但却抑制NY3菌的生长。共存小分子有机酸对NY3菌降解烃的促进机制各不相同。共存戊二酸主要因能上调胞内alk B1和alk B2的表达,提高胞内酶活,从而加快烃的胞内氧化速度,同时能提高胞外吩嗪类物质分泌量,提高胞外以自由基机理氧化降解烃的效率。而共存草酸抑制NY3菌的生长,且显著下调了NY3菌中alk B1和alk B2等关键降解基因的表达水平。其促进NY3菌降解烃的机理是使分泌于胞外液中的吩嗪-1-羧酸(PCA)提高了6.7%,而分泌的PCA在胞外可与NADH或GSH结合,以自由基机理使烃降解率提高约26-28%。(4)NY3菌可迅速的在聚氨酯泡沫(PUF)表面形成固定化生物膜。该生物膜在较宽的p H值范围和较高盐度下,处理2 g/l高浓度含油废水,运行40 d内,可使油去除率稳定在90%左右。运行后的NY3菌固定化生物膜可在甘油作用下曝气恢复其活性,使其循环利用。(5)建立了利用铜绿假单胞菌NY3处理石化企业蜡质油污泥的方法。油污泥处理工艺中,外加鼠李糖脂通过改善疏水性污染物传质方式、提高NY3菌胞内脂多糖的合成量(细胞体积变大,更加饱满)等提高细胞降解活性和油污泥的处理效率,尤其是蜡质油污泥中长链烃去除率。在快速降解油泥时,NY3菌可将油泥转化为一种粘性且以多糖为主要组分的糖蛋白,该糖蛋白又可反过来促进NY3菌对石油烃的降解。本论文揭示了NY3菌胞外活性小分子及其以自由基机理氧化降解烃类物质的规律。明确了两个烃降解转化产物戊二酸和草酸对NY3菌降解烃类污染物各自不同的促进机制,建立了NY3菌固定化生物膜处理高浓度含油废水及游离菌处理蜡质油泥的新工艺,并研究了胞外鼠李糖脂助力于NY3菌快速代谢烃类污染物的作用机理。揭示了NY3菌降解污染物机理的多样性。
[Abstract]:P . aeruginosa NY3 is widely used in hydrocarbon polluted environment . It has excellent degradation ability of petroleum hydrocarbon . The higher the total concentration of phenazine - like substance in the extracellular fluid of NY3 , the higher the degradation rate of hexadecane in the extracellular fluid , the higher the total concentration of phenazine - 1 - amide ( PCN ) , phenazine - 1 - carboxylic acid ( PCA ) and 1 - hydroxyphenazine ( HPE ) . In this paper , the growth rate of NY3 bacteria and the degradation rate of hexadecane can be improved by improving the expression of extracellular phenazine - 1 - carboxylic acid ( PCA ) .

【学位授予单位】：西安建筑科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：X172

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