rCHO细胞培养表达的单克隆抗体电荷异质性研究

发布时间：2018-01-30 12:36

本文关键词： rCHO细胞单克隆抗体电荷异质性赖氨酸变体培养温度金属离子碱性氨基酸　出处：《华东理工大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来抗体药物市场高速增长,应用动物细胞大规模培养技术高效生产抗体药物已成为了当今生物医药产业的核心技术。作为一类糖蛋白,抗体药物在生产过程中会发生一系列的翻译后修饰和降解,从而导致其异质性的出现。电荷异质性是抗体药物的一项关键质量属性,在抗体药物的有效性和安全性等临床特性方面发挥着重要的作用。然而,由于缺乏对电荷异质性这一关键质量属性及其与细胞培养过程关系的认识,抗体药物电荷异质性的有效控制仍是当今抗体药物开发和产业化面临的难题。正确认识和理解抗体药物的临床特性、质量属性和细胞培养过程三者之间的关系,尤其是电荷变体的生成及其与细胞培养过程之间的关系,对科学指导建立高产、优质、稳定的抗体药物生产过程具有十分重要的意义。为此,本文以表达抗CD20单克隆抗体的重组rCHO细胞为研究对象,首先通过质量分析方法对抗体电荷异质性的基本特征进行考察和了解,在此基础上,通过无细胞冷模实验和动力学模型的建立,分析和认识细胞培养过程中抗体酸性电荷变体以及碱性电荷变体(赖氨酸变体)的生成过程,同时考察培养温度以及培养基组分等培养工艺参数对抗体电荷异质性的影响,为后续rCHO细胞高效培养过程的建立以及抗体药物电荷异质性的有效控制奠定基础。本文首先考察了前期建立的rCHO细胞流加培养过程,认识了细胞生长、抗体合成以及抗体电荷分布等基本表现。结果表明,培养过程中最大活细胞密度达到10.5×106cells/ml,最终抗体浓度达到3181mg/L,抗体的平均比生产速率为28.21mg/109cells/day。然而,弱阳离子交换色谱WCX检测结果表明,该工艺过程生产的抗体中含有较高的酸性和碱性电荷变体,至培养结束时两者分别达到了 27.7%和34.9%。为了考察抗体电荷变体的生成位置、来源及其对生物学功能的影响等基本特征,本文首先使用木瓜蛋白酶酶切的方法确定抗体电荷变体的生成位置,结果表明导致抗体电荷变体生成的后修饰或降解位点同时位于抗体的Fab片段和Fc片段。其次使用WCX对抗体的各电荷变体组分(包括酸性组分、碱性组分以及主峰)进行了成功的分离和收集,并检测了各电荷变体组分的聚体含量、还原型片段含量、糖型结构、抗原抗体结合能力以及CDC生物学活性。结果表明,抗体酸性组分中聚体含量、还原型片段含量以及唾液酸化的糖型含量均显著高于碱性组分,说明聚体、还原型片段以及唾液酸都是抗体酸性电荷变体的重要来源。此外,抗体酸性和碱性电荷变体的生成均导致其抗原结合能力和CDC生物学活性的大幅下降。由此可见,电荷异质性是抗体的一项关键质量属性,有必要对它的生成过程及其与细胞培养过程的关系进行深入的研究。针对本文rCHO细胞培养过程中出现的高含量酸性电荷变体,首先通过无细胞冷模实验和动力学模型的分析计算,深入认识了细胞培养过程中抗体酸性电荷变体的生成过程。实验结果表明,细胞培养过程中抗体酸性电荷变体的生成同时发生于细胞内和细胞外,涉及胞内和胞外两个过程。其中,胞外部分抗体酸性电荷变体的生成是一个自发进行的非酶促过程,受培养温度和培养基组成等因素的影响,降低培养温度可在一定程度上减缓胞外抗体酸性电荷变体的生成。动力学研究结果表明,胞外部分抗体酸性电荷变体的生成过程符合一级反应动力学规律和阿仑尼乌斯方程,而且抗体分子中天冬酰胺的去酰胺化反应有可能是导致胞外抗体酸性电荷变体生成的主要原因。此外,建立了抗体酸性电荷变体生成的动力学模型。通过动力学模型的计算和分析,发现胞外部分生成的抗体酸性电荷变体在整个抗体酸性电荷变体中占主导地位(占了 74.9%)。同时,当细胞培养过程进入后期,细胞分泌的抗体中所含酸性电荷变体的含量(Qa值)也迅速上升,进一步的研究表明,Qa值的上升与分泌抗体中片段以及聚体含量的上升密切相关。温度的降低可以有效减少胞外部分抗体酸性电荷变体的生成,为此本文进一步通过考察培养温度这一关键过程参数对rCHO细胞生长、抗体合成以及抗体电荷分布的影响,发现降低培养温度对rCHO细胞的生长和活性维持均无显著影响,但却不利于抗体的合成,同时影响抗体的电荷分布。当培养温度从37℃下降到32℃时,最终的抗体浓度从3532 mg/L下降到了 2436mg/L,同时抗体的比生产速率从29.15mg/109cells/day下降到了 12.29 mg/109cells/day。在抗体电荷分布方面,降温虽然降低了抗体的酸性电荷变体含量,但同时提高了碱性电荷变体含量,两者相抵后对抗体的主峰含量无显著贡献。当培养温度从37℃下降到32℃时,抗体酸性电荷变体含量下降了 9个百分点,但碱性电荷变体含量提高了 7个百分点。此外,降温时间的调整同样影响了 rCHO细胞抗体的合成以及抗体的电荷分布。降温时间越早,最终的抗体浓度也就越低,第4天降温获得的抗体浓度仅为第10天降温的66.2%。推迟降温时间,使得抗体的酸性电荷变体含量升高,而碱性电荷变体含量降低,最终获得的抗体主峰含量基本保持不变。当降温时间从第4天推迟到第10天时,抗体的酸性电荷变体和碱性电荷变体含量分别上升和下降了 4个百分点。针对rCHO细胞培养过程中出现的高含量碱性电荷变体,首先通过碱性羧肽酶酶切的方法检测了抗体的赖氨酸变体含量,结果表明高含量的赖氨酸变体是导致抗体碱性电荷变体含量升高的主要原因。培养结束时,抗体的赖氨酸变体含量高达16.8%,占了所有碱性电荷变体的一半左右。因此,降低赖氨酸变体含量是控制抗体碱性电荷变体的有效手段。通过考察培养温度、培养基中的金属离子(铜离子和锌离子)以及碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)等培养工艺参数对抗体C末端赖氨酸酶切过程以及赖氨酸变体含量的影响,发现降低培养温度能够显著提高抗体中的赖氨酸变体含量。RT-PCR检测结果表明,CpB和CpH是rCHO细胞中负责催化抗体C末端赖氨酸酶切过程的两种碱性羧肽酶。降温显著降低了 CpB的表达,从而影响了抗体C末端赖氨酸的酶切过程以及赖氨酸变体的含量。培养基中的铜离子和锌离子在rCHO细胞的生长、抗体合成以及电荷分布等方面都发挥着重要的作用。在抗体电荷分布方面,铜离子和锌离子作为碱性羧肽酶的抑制剂和辅因子,对碱性羧肽酶的活性分别具有抑制和激活作用,因此会显著影响抗体C末端的赖氨酸酶切过程,通过调节培养基中铜、锌离子的浓度及其比例可以有效控制抗体的赖氨酸变体含量。此外,培养基中高浓度的碱性氨基酸(精氨酸和赖氨酸)同样会引起抗体赖氨酸变体含量的升高。实验结果表明,胞内外碱性氨基酸的浓度与其作为产物的抑制常数Ki值十分接近,说明培养基中的高浓度碱性氨基酸有可能存在对碱性羧肽酶的产物抑制效应,从而导致抗体赖氨酸变体含量的提高。无细胞冷模实验结果在一定程度上验证了这种产物抑制效应的存在。最后,本文通过无细胞冷模实验以及动力学模型的计算分析,进一步认识了细胞培养过程中抗体C末端的赖氨酸酶切过程。实验结果表明,抗体C末端的赖氨酸酶切过程也由胞内和胞外两部分组成,其中胞外酶切过程符合一级反应动力学规律,并且随着培养过程的进行,其反应速率常数k值以及酶切速率都逐渐提高,而胞内部分的酶切速率在细胞培养后期则有所下降。此外,动力学模型的计算结果表明胞内部分在整个抗体C末端的赖氨酸酶切过程中占主导地位(占了 93.6%)。通过本文的研究,深入认识了细胞培养过程中抗体电荷变体的生成过程,丰富了人们对抗体电荷变体与细胞培养过程之间关系的认识,为rCHO细胞高效培养过程的建立和抗体电荷异质性的有效控制奠定了基础。
[Abstract]:In order to understand and understand the relationship between cell growth , antibody synthesis and antibody charge distribution , it is very important to understand and understand the relationship between cell growth , antibody synthesis and antibody charge distribution . The results show that the generation of acidic charge variants of the extracellular part is a spontaneous non - enzymatic process , which can reduce the formation of acidic charge variants of extracellular antibodies . At the end of culture , the content of acid charge of the antibody was decreased by 9 percentage points , but the content of the antibody was decreased by 7 percentage points . The results showed that the enzyme - cutting process of the antibody C - terminal was consistent with the kinetics of the first - order reaction , and the enzyme - cutting rate of the intracellular part decreased after the cell culture . The results of the kinetic model showed that the intracellular part was dominant in the process of lysine enzyme digestion at the end of the whole antibody ( 93.6 % ) . Through the research in this paper , the formation process of antibody charge variants in cell culture is deeply recognized , and the understanding of the relationship between antibody charge variants and cell culture processes is enriched , which lays the foundation for the establishment of efficient culture process of rCHO cells and the effective control of antibody charge heterogeneity .

【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ460.1

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