三类重要渔药残留免疫快速检测技术

发布时间：2018-02-15 07:06

本文关键词： 水产品单克隆抗体 ELISA 胶体金试纸条　出处：《江南大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：近年来,水产品安全事件频出,严重影响我国水产品出口贸易及消费者健康。随着各部门对药物残留的监管力度加大,对相关检测技术要求也更高。高灵敏、高通量、快速简便是今后检测技术发展的趋势。本研究以水产品中药物残留较为严重的喹诺酮类抗生素、喹恶啉类促生长剂和亚甲基蓝消毒剂三类危害因子为研究对象,以抗原设计为切入点,制备高灵敏的单克隆抗体并建立相应的免疫快速检测技术。(1)本研究设计并合成了10种喹诺酮类半抗原及相应的完全抗原,通过免疫小鼠,抗血清筛选阶段,确征了效果较好的免疫原,经细胞融合和抗体制备过程,获得了3种具有不同识别能力的喹诺酮类单克隆抗体,通过异源包被筛选,确定了最佳抗原抗体组合,提高了方法灵敏度,并建立了相应的间接竞争ELISA法。其中抗体1C9,对应免疫原为诺氟沙星氨基衍生物-KLH(NOR-NH2-KLH),包被原为帕珠沙星-OVA(PAZ-GA-OVA),针对NOR的ELISA方法其IC50为0.12 ng/m L,线性范围为0.05-0.25ng/m L,交叉反应大于10%的喹诺酮药物为20种。抗体1E5,对应免疫原为那氟沙星氨基衍生物-KLH(NAD-NH2-KLH),包被原为PAZ-GA-OVA,对应的针对NAD的ELISA方法其IC50为0.19 ng/m L,线性范围为0.05-0.74 ng/m L,交叉反应大于10%的喹诺酮药物为14种。抗体3E4,对应免疫原为沙拉沙星羧基衍生物-KLH和诺氟沙星羧基衍生物-KLH(SAR-COOH-KLH和NOR-COOH-KLH)的混合免疫原,包被原为SAR-OVA,对应的针对SAR的ELISA方法其IC50为0.52 ng/m L,线性范围为0.09-2.94 ng/m L,交叉反应大于10%的喹诺酮药物为21种。(2)建立了基于单克隆抗体3E4的可同时检测32种喹诺酮类药物的胶体金层析试纸条。金标抗体的最佳p H和最佳标记量为1 m L胶体金溶液6μL 0.1 mol/L K2CO3溶液,40μL 0.2 mg/m L抗体,检测抗原浓度为0.5 mg/m L。其比色法的消线值在1-100 ng/m L之间,检测限在0.25-10 ng/m L之间,可以满足牛奶中喹诺酮类药物的限量要求,适用于现场快速检测。(3)合成了喹乙醇半抗原OLA-HS,并成功筛到了通用型的喹恶啉类单克隆抗体,利用通用型抗体2F3建立了鱼饲料中喹恶啉类药物的间接竞争ELISA方法。其最佳工作条件为:选用喹乙醇代谢物MQCA的氨基己酸衍生物偶联蛋白(MQCA-ACA-OVA)作异源包被原,包被浓度为0.3μg/m L,抗体2F3浓度为0.11μg/m L,标品溶液为Na Cl浓度为1.6%,p H为8.2的硼酸盐缓冲溶液。在最佳工作条件下,IC50为1.03 ng/m L,线性范围为0.05-0.25 ng/m L,相关系数为0.997,对乙酰甲喹,喹烯酮和卡巴氧的交叉分别为67%,60%和0.9%。对鱼饲料样品进行了添加回收实验,ELISA的回收率在82.1%-96.3%。(4)设计并合成了5种MQCA半抗原,分别暴露出分子结构的两端作抗原决定簇,制备了能够特异性识别MQCA的单克隆抗体,并建立了鱼肉中MQCA残留的间接竞争ELISA方法。通过异源包被筛选,得到最佳的抗原抗体组合。所制备的抗体1A11,对应免疫原为MQCA-(NH2)4-KLH,包被原为MQCA-NH2-OVA,在最佳工作条件(包被浓度0.03μg/m L和抗体浓度为0.3μg/m L,标品稀释液为Na Cl浓度为1.6%,p H为7.4的PBS溶液)下,IC50为3.17 ng/m L,线性范围为0.58-17.29 ng/m L,平均回收率在81.6%-90.7%之间,变异系数在3.95%-7.1%之间,适用于鱼肉中MQCA的残留检测。(5)建立了基于单克隆抗体1A11的MQCA胶体金层析试纸条,金标抗体的最佳p H和最佳标记量为1 m L胶体金溶液4μL 0.1 mol/L K2CO3溶液,50μL 0.2 mg/m L抗体,检测抗原浓度为0.5 mg/m L。其比色法的消线值为5 ng/m L,检测限在0.25 ng/m L,适用于鱼肉中MQCA残留的现场快速检测。(6)设计并合成了新型亚甲基蓝半抗原,制备了能够特异性识别亚甲基蓝的单克隆抗体,利用所制备的抗体1H4建立了鱼肉中亚甲基蓝残留检测的间接竞争ELISA方法。最佳工作条件为包被浓度0.1μg/m L和抗体浓度为0.1μg/m L,标品稀释液为Na Cl浓度为1.6%,p H为7.4的PBS溶液,IC50为21.13 ng/m L,线性范围为4.26-104.83 ng/m L.对鱼肉样品进行添加回收实验,回收率为82.1%-90.1%,适用于实际样品检测。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS254.7

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