纳米颗粒的核酸递送功能及安全应用评价研究

发布时间：2018-03-15 09:11

本文选题：RNAi　切入点：阳离子化明胶微球　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景和目的:RNA干扰(RNAi)对于人类基因相关疾病的治疗,特别是抗肿瘤治疗具有重要的意义。迄今RNAi的作用机理已经非常明晰,并且有多种核酸药物(siRNA、shRNA、miRNA、dsiRNA)和核酸递送载体(病毒、脂质体、阳离子聚合物、金属或无机纳米颗粒等)得到广泛关注与研究。常用的核酸递送载体主要包括病毒载体和非病毒载体。病毒载体转染率高,但存在核酸装载量有限以及具有免疫原性和安全性风险等问题;非病毒载体安全、稳定,但转染效率相对较低。因此,构建安全、高效的非病毒核酸递送载体是RNAi技术研发中面临的一个重要挑战。明胶来源于动物的皮肤和骨骼,可生物降解,并具有生物相容性好和易被化学修饰等特点,是制备药物载体的一种重要生物材料。本课题的总体思路是合成阳离子化明胶分子,对传统两步溶解法进行改进,制备出尺寸分布均一的阳离子化明胶微球(cationic gelatin nanoparticles,CGN);其目的是保护核酸物质免于核酸酶降解,同时,实现核酸药物缓释而延长其作用时间。通过细胞实验探究阳离子化明胶分子的交联度、培养基中血清浓度以及细胞种类等因素对阳离子化明胶微球介导CXCR4 siRNA发挥干扰效果的影响规律。方法:通过向明胶分子中导入乙二胺制备阳离子化明胶;以戊二醛为交联剂,通过对传统两步溶解法进行改进来制备不同交联度的阳离子化明胶微球(CGN),并以非阳离子化明胶微球(gelatin nanoparticles,GN)作为对照。采用扫描电子显微镜(SEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)等方法对CGN形貌、尺寸及其在水溶液中的水合粒径、Zeta电位等参数进行表征和检测。使用1%琼脂糖凝胶电泳法检测CGN与siRNA的结合,采用DLS法检测CGN与siRNA复合物(CGN@siRNA)的水合粒径和Zeta电位。采用CCK8法检测GN、CGN、CGN@siRNA对小鼠乳腺癌细胞4T1的细胞毒性,以及血清含量对细胞活性的影响。应用流式细胞术检测CGN@siRNA的细胞摄取情况;通过激光共聚焦显微镜(confocal)观察CGN@siRNA在细胞中的定位。采用Real Time PCR方法在肿瘤细胞株上检测和评价交联度、血清浓度以及细胞种类对CGN介导的CXCR4 siRNA干扰效率的影响规律。结果:(1)制备了五种不同交联度的CGN;SEM结果显示,CGN为形貌规整的球形,尺寸均一;随着交联度的增加,CGN的平均粒径依次为488±103.17、412±67.93、328±68.34、297±64.80、280±72.08 nm;在水溶液中,相应的水合粒径依次为652±10.61、533±2.83、375±7.07、367±7.08、358±3.54nm;Zeta 电位均在+40mV左右,表明CGN表面带正电。(2)凝胶电泳结果显示,当CGN与siRNA质量比大于4以后,两者能够完全结合。(3)CCK8法检测结果表明,CGN对4T1细胞的毒性作用具有浓度依赖性和尺寸效应;而GN和CGN@siRNA的细胞毒性要低于CGN;另外,培养基中血清浓度降低会使CGN@siRNA的细胞毒性增大。(4)流式细胞术分析结果显示,交联度越大,CGN@siRNA进入4T1细胞的能力越强;血清浓度越低,越有利于细胞对CGN@siRNA的摄取;不同种类细胞对CGN@siRNA的摄取也各不相同。(5)Confocal观察结果表明,CGN@siRNA进入细胞后主要分布在溶酶体中。(6)RealtimePCR检测结果表明,CGN与CXCR4siRNA复合物(CGN@siCXCR4)能有效沉默4T1细胞CXCR4的表达,干扰效率接近商用载体Lipofectamine 3000;沉默效果可持续96 h,并与CGN交联度相关;降低培养基血清浓度有利于增强干扰效率;此外,CGN@siCXCR4在其他不同种类的肿瘤细胞中的干扰效果不同。结论:刚离子化明胶微球可在多种肿瘤细胞株上有效介导CXCR4的RNA干扰,并且基因沉默时间长,可实现siRNA的缓释,是一种很有潜力用于抗肿瘤治疗的siRNA递送载体。目的:纳米银(AgNPs)优越的抗菌性吸引了人们对食品、农业、家用电器、纺织用品、医疗器械和环境保护等多领域产品的研发兴趣。但是随着在日常生活中的广泛暴露,纳米银带来的安全、环境和健康等问题也引起了学术界和相关监管部门的密切关注。研究显示,纳米银通过静脉注射、口服、吸入等暴露途径进入生物体后,在心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸等器官中都有分布,主要通过作用于生物膜、诱导产生ROS、损伤核内DNA以及释放Ag+等途径抑制细胞生长或杀死细胞,由此导致全身毒性。目前关于纳米银对血管内皮作用的研究主要集中在细胞毒性方面,关于其对血管内皮细胞间相互连接的影响以及与银离子细胞毒性机制的差异目前还不完全清楚。本课题在原代人脐静脉血管内皮细胞上探究纳米银和硝酸银对血管内皮连接的影响以及两者产生细胞毒性的机制差异,并采用尾静脉暴露方式观察小鼠血管外周组织的病理改变,验证两者对血管内皮完整性的影响及其所引起的全身毒性。方法:本研究选用三种不同尺寸AgNPs(10、75、110nm),初始浓度为1mg/mL,表面由2mM柠檬酸钠包被,设AgNO3作为对照。在材料表征方面,采用透射电镜(TEM)观察AgNPs的形貌和尺寸分布;通过动态光散射(DLS)检测AgNPs的水合粒径和Zeta电位。在细胞实验中,将原代人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)作为研究对象,通过CCK8法检测AgNPs和AgNO3对细胞活性的影响;利用Hoechst/PI双荧光染色法观察两者引起的细胞凋亡和坏死情况;使用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)检测HUVEC细胞内银元素含量,评价AgNPs和AgNO3的细胞摄取情况。采用TEM和能谱色散仪(EDX)对AgNPs在细胞内的定位进行分析。通过激光共聚焦扫描电镜(confocal)观察AgNPs或AgNO3作用后细胞的钙粘蛋白(VE-cadherin)和肌动蛋白(Actin)表达水平,探究两者对内皮细胞间连接和细胞骨架的影响。通过流式细胞检测仪和荧光显微镜检测DCF的荧光强度,评价两者引起的胞内ROS水平改变。在体内验证实验中,通过多次尾静脉注射AgNPs或者AgNO3到小鼠体内,收集小鼠肝脏、肾脏和肺组织,利用显微镜观察AgNPs引起的病理改变情况;通过TEM观察AgNPs在肝脏、肾脏和肺中的分布。结果:(1)理化表征结果显示,三种尺寸的AgNPs均呈颗粒状分布,尺寸均一;粒径大小为11 ± 1、76± 6和107± 8 nm。在水溶液中的水合粒径分别为9.8 ± 3.2、72.0 ± 0.9、99.3±1.7nm;在 5%葡萄糖溶液中分别为 10.7±3.3、78.9±0.9、116.8±2.6nm;在完全培养基中静置至48 h后,粒径分别为12.6 ±3.9、104.6 ±0.2、147.0 ±1.7 nm,说明AgNPs能稳定的分散在水溶液、5%葡糖糖以及完全培养基中。在水溶液中的Zeta电位依次为-42.3±1.4、-45.5±0.7、-44.5±0.4mV;在 5%葡萄糖中依次为-35.7±0.1、-38.2± 1.1、-37.7 ±0.6 mV;在完全培养基中静置 48 h 后依次为-7.9 ±0.5、-8.0 ±1.1、-7.2 ±1.0 mV,说明AgNPs表面均带负电。(2)AgNPs的细胞毒性具有浓度依赖性和尺寸效应,主要引起细胞凋亡;AgNO3的毒性作用明显强于AgNPs,主要引起细胞坏死。(3)AgNPs能够被HUVEC细胞大量摄取并且分布在溶酶体中;而AgNO3不能被细胞摄取。(4)AgNPs作用于HUVEC细胞后使胞内ROS水平显著升高,能减少内皮细胞间连接并且破坏细胞骨架完整性;AgNO3没有引起上述现象。(5)抗氧化剂NAC提前处理细胞能降低AgNPs引起的胞内ROS升高水平,削弱AgNPs异致的内皮细胞间连接减少现象,降低AgNPs对内皮细胞产生的毒性作用。(6)多次尾静脉注射AgNPs引起小鼠肝脏、肾脏和肺组织中血管周围炎症细胞聚集,产生明显血管周炎症反应,而AgNO3没有这种现象。尾静脉注射AgNPs主要分布在肝脏组组织中。结论:AgNPs能够被血管内皮细胞大量摄取,引起细胞内ROS水平显著升高,使血管内皮细胞间连接减少,导致内皮泄露,进而招募周围炎症细胞在血管周围聚集,引起了小鼠肝脏、肾脏和肺组织中明显的血管周围炎症反应。与此相反,AgNO3没有被内皮细胞大量摄取,主要通过介导细胞坏死产生细胞毒性。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R318.08;TB383.1

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