黄酮类化合物与羟基喜树碱的联合抗癌作用及机理研究

发布时间：2018-03-18 02:27

本文选题：黄芩素　切入点：羟基喜树碱　出处：《大连理工大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：黄酮类化合物是自然界中分布最为广泛的一类的化合物,普遍存在于水果、蔬菜和中药中,具有抗氧化、抗炎症、抗菌和抗病毒等生物功能。研究表明,它们还具有潜在的抗肿瘤活性。但是,目前能够实际应用到临床治疗肿瘤的黄酮类化合物几乎没有,究其根本原因是黄酮类化合物的抗癌活性比较低。那么,如何提高黄酮类化合物在抗肿瘤方面的使用价值,是本研究的最终目的。本课题从两个方面对这一问题进行了探讨:一是以黄酮类化合物为辅药,与羟基喜树碱联合用药进行抗癌研究;二是以黄酮类化合物为母体,对它进行化学改造以期得到一种高效低毒的抗肿瘤药物。主要方法、结果和结论如下:(1)首先通过MTT法检测,发现低剂量(15.625 μM)的黄芩素能够显著的增强羟基喜树碱对癌细胞如BGC823、MCF7和SMMC7721增殖的抑制作用,可将羟基喜树碱的使用剂量降低至1/4,联用指数CI～0.4。然后通过Annexin-FITC/PI双染、PI单染、罗丹明123单染和western blot来探究黄芩素和羟基喜树碱联合作用BGC823细胞48 h后对细胞周期和细胞凋亡的影响,结果表明:黄芩素和羟基喜树碱联用后显著增加细胞凋亡数量、上调Bax/Bcl-2的比例、加剧线粒体膜电位的下降、增加cleaved-caspase-3/9的含量并剪切PARP-1,但是对pro/cleaved-8的含量没有影响,说明二者的联用是依靠线粒体而非死亡受体途径来诱导BGC823细胞凋亡;另一方面联用组能够将BGC823细胞周期阻滞在G1和G2/M期,并上调细胞周期抑制蛋白p21和p53的含量。通过彗星实验发现联用组能够增强DNA的损伤。接着,通过DCFH-DA单染、DHE单染和DNA松驰实验分别研究了 DNA损伤的可能诱因活性氧和拓扑异构酶Ⅰ(Topomerase Ⅰ,Topo Ⅰ)催化活性的变化,结果表明:黄芩素和羟基喜树碱联用增加了 BGC823细胞中的活性氧含量,但是联用组对BGC823细胞的抑制作用并不能被抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸所拮抗,表明二者的协同作用并不是通过增加活性氧的含量来实现;另一方面,低浓度(15.625μM)的黄芩素能够显著增强羟基喜树碱对Topo Ⅰ催化活性的抑制作用,同时高浓度(125μM)的黄芩素本身也能抑制Topo Ⅰ的催化活性,因此推测Topo Ⅰ是黄芩素和羟基喜树碱的协同靶点。最后,BGC823细胞裸鼠移植瘤实验结果表明,黄芩素(5mg/kg)和羟基喜树碱(3 mg/kg)联用的抑瘤率为67.60±6.56%,而3 mg/kg与9 mg/kg羟基喜树碱单用组的抑瘤率分别为20.60±5.23%和64.88±5.51%(2)通过MTT法检测发现10 μM其他食用类黄酮如槲皮素、芹菜素、木犀草素和白杨素也可以显著增强羟基喜树碱对MCF7细胞增殖的抑制作用,可将羟基喜树碱的使用剂量降低至1/8,联用指数CI0.3。通过DNA松弛实验、PI单染、Annexin-FITC/PI双染、罗丹明123染色和western blot等实验研究了,羟基喜树碱和槲皮素在乳腺癌MCF7细胞中的协同抗癌作用,结果如下:10 μM槲皮素也能够增强羟基喜树碱对TopoⅠ催化活性的抑制作用;药物作用6 h后,0.62 lμ羟基喜树碱和10 μ槲皮素联用组的组蛋白H2A.X上的Ser139的磷酸化开始增加,表明二者的联用增强了细胞内的DNA损伤;随着时间的推移(12-24-48 h),联用组的细胞周期经历了 G1期阻滞,偏向G2期的S期阻滞和G2/M期的阻滞;细胞周期调控相关蛋白ATM和Chk1抑制剂处理MCF7细胞24 h后,再加药物作用48 h,ATM抑制处理的细胞会对羟基喜树碱更为敏感但对联用组没有影响,而Chk1抑制剂处理的细胞则对二者都敏感,说明联用组的细胞周期阻滞是由ATR-Chk1途径介导的;联用组中p21的含量从药物作用3 h后就开始显著增加,而p53的含量是从药物作用后6h才开始增加的,说明MCF7细胞内存在非p53依赖的途径来介导p21的表达;用p53抑制剂Pifithrina(Pft-a)预处理的细胞会对羟基喜树碱更为敏感但对联用组没有影响,表明p53并不会对联用组产生抗性;联用组在凋亡方面的影响是同黄芩素和羟基喜树碱联用的效果一样,都是依赖于线粒体途径而非死亡受体途径来诱导细胞的凋亡,另外用100μMcaspase广泛抑制剂预处理细胞后再加入药物,联用组对MCF7细胞的抑制作用显著下降,进一步说明了联用组是通过凋亡来诱导细胞死亡;MCF7细胞裸鼠移植瘤的实验表明,尽管1mg/kg羟基喜树碱和5mg/kg槲皮素联用组以常规方式给药的药效弱于瘤旁组,但它的抑瘤率可达到50.16±3.20%,而1 mg/kg与8 mg/kg羟基喜树碱单用组的抑瘤率分别为25.60 ± 2.20%和57.66 ± 4.50%。(3)以DNA嵌入剂的结构特点设计并合成了一系列的白杨素衍生物,而后用MTT法检测它们对肿瘤细胞Hela、BGC823、MCF7、HepG2和正常细胞HEK293的抑制作用,发现5-(2'-氨基)苯基-7-环己基甲基白杨素(Ch-1)的抑癌作用最强,尤其是在Hela细胞中呈现断崖式的抑制作用,而对正常细胞的抑制作用相比较弱。另外,圆二色实验表明,Ch-1能够嵌入到DNA中。而后通过Annexin-FITC/PI双染、罗丹明123单染、PI单染和westem blot等实验研究Ch-1作用Hela 48 h后对细胞周期和凋亡的影响,结果发现:25μM Ch-1将Hela细胞阻滞在G1期;另一方面,25μM Ch-1能够增加Hela细胞的凋亡、降低pro-caspase-3/8/9的含量、加剧线粒体膜电位的下降、增大Bak/Bcl-2的比例、减少Bid的含量和上调DR5,表明线粒体和死亡受体途径都参与了 Ch-1诱导的Hela细胞凋亡;另外,25 μM Ch-1可以显著上调p53的含量,且用125μM Pft-a预处理的Hela细胞对Ch-1的敏感度降低,而且凋亡相关蛋白的变化也被废除,表明Ch-1是由p53介导Hela细胞的凋亡。另一方面,2.5-10 μM Ch-1能够显著增强羟基喜树碱对癌细胞增殖和TopoⅠ催化活性的抑制作用;而且,白杨素的其他衍生物也能增强羟基喜树碱的抑癌作用,且以5-(2'-氨基)苯基白杨素(Ch-3)的增强能力最好。综上所述,本论文一方面发现低剂量的黄芩素、槲皮素、芹菜素、木犀草素和白杨素等黄酮类化合物能够显著增强羟基喜树碱的抑癌作用,可将羟基喜树碱的使用剂量将至1/3之下,并确定二者的协同靶点是TopoⅠ,为联合疗法提供了一种新的组合模式;另一方面,以白杨素为前体化合物,合成了一种新型的DNA嵌入剂Ch-1,在Hela细胞中呈现断崖式的抑制作用,且对正常细胞的杀伤能力较弱,为子宫颈癌的治疗提供了一种新的可能性;而且,Ch-1和其他的白杨素衍生物在低剂量下也能显著增强羟基喜树碱对癌细胞的抑制作用。
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【学位授予单位】：大连理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ460.1

【参考文献】