基于DNA探针的荧光生物传感新方法用于DNA甲基转移酶活性检测的研究

发布时间：2018-04-01 10:28

  本文选题：DNA甲基转移酶　切入点：DNA探针　出处：《山东大学》2017年博士论文

【摘要】：DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNAMTase)是存在于表观遗传学中的一种修饰蛋白酶,其通过催化DNA甲基化过程而参与许多生物学过程并在其中发挥重要作用,如调节基因的表达和发育等。然而,DNAMTase活性的异常使得DNA甲基化表达水平异于常态,且异于常态的DNA甲基化水平通过失活肿瘤的抑制基因或沉默基因表达的转录而引发多种类型的疾病,如发育异常、自身免疫性疾病及多种类型的癌症等。因此,精确且灵敏的检测DNAMTase活性对诊断疾病的发展阶段和类型具有指导价值。目前,核酸酶消化法因酶切反应的高效特异性在DNAMTase活性的检测中引起了极大的关注。在该方法中,作为识别探针的DNA探针经目标识别事件后,被核酸酶消化切割实现对目标DNAMTase的转导,继而辅助以用于信号输出的各种技术手段达到对目标物的检测。其中荧光技术辅助的生物传感法以简单、快速及灵敏的特性被用于DNAMTase活性检测中。但仍存在一些问题需解决,即扩增效率低、识别探针封闭不完全、转导效率低等问题对改善现有灵敏度存在局限性,及检测过程中所需过量辅助探针对信号造成的干扰,同时增加自身设计复杂性等问题。以DNAMTase为研究模型,针对目前检测方法中存在的上述问题,本论文展开了相关性的研究。本论文共分为六章,且将每个章节的主要内容总结如下:第一章是绪论部分,主要概括阐述了 DNAMTase的含义、功能、分类及研究意义。并且总结了 DNAMTase活性检测的方法,对检测中存在的问题进行了简单概括。此外,对目前荧光生物传感法的原理、分类及其生物学应用进行了归纳总结。第二章,基于链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)和DNAzyme扩增反应,构建了一种荧光双扩增策略灵敏检测DNA MTase活性。首先,在所设计的双链识别探针中引入SDA的引物和模板、DNAzyme的合成模板,将SDA和DNAzyme扩增反应有效的结合起来。其经目标物作用后,保持原有双链结构不变。其中的短链作为SDA的引物、长链作为模板,在酶辅助下引发SDA反应。而且识别探针中含有DNAzyme合成模板,这使得其经上述扩增反应后合成游离的DNAzyme序列,继而引发分子信标底物的循环切割,释放大量含荧光团的短链,荧光信号得以恢复,实现对DNAMTase活性的检测。该策略将两大扩增反应结合,大大提高了扩增效率,确保了检测策略的高灵敏度,相应的检测限为0.0082 U/mL。第三章,以 SDA 和指数滚环扩增(exponential rolling circle amplification,ERCA)反应为基础,设计了一种环介导的级联扩增策略超灵敏精确检测DNA MTase活性。在该设计中,作为识别探针的长茎环探针经甲基化事件后,释放环部及其附近区域,其作为引发后续过程的引发链。其中,长茎环探针中的长茎部区域有两方面的作用:一方面维持探针的稳定性或确保探针的有效形成,另一方面将引发链有效地封闭,以防出现探针泄漏引起的非特异扩增。释放的引发链与发夹探针杂交,进而引发SDA反应,生成引物链。该引物链与含切割位点的挂锁探针杂交,继而触发ERCA反应。结合级联扩增反应的高扩增效率和长茎环探针的高稳定性两大特点,实现对DNA MTase活性的高灵敏精确检测,检测限低至 8.1×10-5U/mL。第四章,利用双环探针对引物链的有效封闭作用,发展了一种多重封闭引物介导的滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)策略用于检测 DNA MTase的活性。我们设计了含多个引物链的双环探针,其在DNAMTase作用下释放多重转导链,该转导链作为引物(完整引物或分裂引物)触发RCA反应。这种存在于目标物和转导链间的1:N的转导模式,其转导效率高,有效改善了 DNA MTase活性检测的灵敏度。且通过改变双环探针中引物链的个数,可对酶活性的检测实现可控性。随着双环探针中封闭引物个数的增加,检测灵敏度得到相应的改善。且每增加一个封闭引物,检测限大约降低一个数量级。将1:N转导模式的高转导效率和RCA反应的高扩增效率结合起来,有效改善了酶活性检测的灵敏度,检测限最大程度低至0.0085 U/mL。当封闭引物个数相同时,相较于完整引物而言,分裂引物所引起的背景信号更低,其相应的检测限也稍微降低。第五章,基于构象转变机理,设计了一种一体化构象可变式探针介导的SDA策略用于DNAMTase活性检测。在作为识别探针的一体化构象可变式探针中设计SDA反应所需的引物和模板链。DNAMTase不存在时,一体化构象可变式探针将引物和模板链封闭。DNAMTase存在时,探针被催化发生甲基化事件,其后经核酸酶切割生成大环小茎的发夹探针。该发夹探针结构不稳定,发生构象转变而激活引物和模板链,触发SDA反应。该设计中,一体化构象可变式探针将识别、转导和信号输出元素结合在一起,大大简化了探针设计过程中的难度。探针设计的简便性和扩增过程的强扩增能力,益于酶活性的简单、灵敏检测,检测限为 0.063 U/mL。第六章是本论文结论部分,主要包括工作总结及前景展望。
[Abstract]:DNA methylase ( DNAMTase ) is a kind of modified protease present in epigenetics , which is involved in many biological processes and plays an important role in the detection of DNAMTase by catalytic DNA methylation . In this paper , we designed a double loop probe with multiple primer chains , which can be used as primer ( complete primer or split primer ) to detect the activity of DNA MTase . This paper designs an integrated conformational variable probe - mediated SDA strategy for the detection of DNAMTase activity in the presence of DNAMTase .

【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：O657.3
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本文编号：1695196