代谢工程改造耶罗维解脂酵母生产β-胡萝卜素研究

发布时间：2018-11-09 12:32

【摘要】：β-胡萝卜素是一种抗氧化、防癌且具有免疫功能的类胡萝卜素,广泛应用于食品添加剂、营养增补剂、化妆品等行业。本文采用代谢工程的手段,结合生物元件的构建、外源基因表达和代谢途径调控等技术,在耶罗维解脂酵母中构建了β-胡萝卜素生物合成途径,优化了异戊二烯途径中的关键基因,并对构建虾青素合成途径的可行性进行了初步研究。首先,从三孢布拉霉或卷枝毛霉中克隆了β-胡萝卜素合成基因,并将其整合到耶罗维解脂酵母的基因组内,构建了合成β-胡萝卜素的重组菌株。整合三孢布拉霉carRA和carB基因的工程菌(YH202)和整合卷枝毛霉carRP和carB(M)基因的工程菌(YM202)的β-胡萝卜素产量分别为4.35 mg/L和3.90 mg/L,结果表明在耶罗维解脂酵母中表达三孢布拉霉β-胡萝卜素合成基因更有利于β-胡萝卜素的生物合成。要提高β-胡萝卜素的产量,增加前体物质的供应十分必要。HMG-CoA还原酶可以催化HMG-CoA生成甲羟戊酸,是甲羟戊酸途径重要的限速步骤。本文对耶罗维解脂酵母的HMG-CoA还原酶基因的催化区域(HMGcata)进行了研究,发现过表达HMGcata将HMG-CoA还原酶的酶活提高了65%,β-胡萝卜素从4.35mg/L提高至6.95 mg/L。在麦角固醇途径中,ERG9基因编码的角鲨烯合酶催化法尼酰基焦磷酸(FPP)合成角鲨烯,是影响FPP流向的关键酶。我们尝试用酿酒酵母中可调控的MET3启动子(硫酸腺苷转移酶硫激酶启动子,ATP硫激酶启动子)或CTR3启动子(铜离子调节型启动子)替换ERG9的Qg源启动子来弱化ERG9基因的表达,但结果不理想,表明源于酿酒酵母的MET3或CTR3启动子在耶罗维解脂酵母中并不起作用。在耶罗维解脂酵母中,大部分类胡萝卜素存储于脂质体中,增加脂质体的产生有助于提高β-胡萝卜素的积累。因此本实验中研究脂质体合成和降解途径的调节对β-胡萝卜素产量的影响。在耶罗维解脂酵母模式菌株H222中分别构建了导入一个拷贝β-胡萝卜素合成基因的菌株H306、敲除GUT2基因(编码3-磷酸甘油脱氢酶异构酶)的菌株H405、敲除POX1-6基因(编码酰基辅酶A氧化酶)的菌株H512、及敲除GUT2及POX1-6的菌株H611。通过分析其生长状态和β-胡萝卜素产量发现,敲除GUT2导致菌株生物量降低9.1%,β-胡萝卜素产量提升4.6倍;敲除POX1-6导致生物量降低15.0%,β-胡萝卜素产量提升5.4倍;GUT2和POX1-6均敲除导致生物量降低30.2%,β-胡萝卜素的产量提升11.5倍。结果表明增加脂质体的产生能促进β-胡萝卜素的积累,但也会影响菌株的生长。URA3/5-FOA筛选系统能够重复地将多个基因整合到耶罗维解脂酵母基因组的不同部位。基于该系统,逐步往耶罗维解脂酵母ATCC20362菌株导入三个β-胡萝卜素合成基因和两个HMGcata基因,并且敲除GUT2与POX2基因,构建了产β-胡萝卜素的工程菌株YC607。随着基因的不断整合,改造菌株的β-胡萝卜素产量逐步增加。YC607菌株摇瓶发酵时最终能够积累72.89 mg/L的β-胡萝卜素,比整合单拷贝β-胡萝卜素合成基因的YH202菌株(4.35 mg/L)增长了16.7倍。接下来探讨不同浓度的葡萄糖与甘油对β-胡萝卜素合成的影响,发现采用4%甘油作为发酵培养基的碳源时,β-胡萝卜素的产量达到96.88 mg/L。采用分批补料发酵的方式在5-L发酵罐中对改造菌株YC607进行高密度培养。分批补加葡萄糖时,生物量和β-胡萝卜素产量最高分别为97.6 g/L和443.02 mg/L。后用甘油替换葡萄糖分批补加,生物量最高时达到130.0 g/L,β-胡萝卜素的产量也达到613.63 mg/L。通过在β-胡萝卜素的工程菌株YC607中导入海洋细菌Agrobacterium aurantiacum的crtZ基因(编码β-胡萝卜素羟化酶)和crt W基因(编码β-胡萝卜素酮化酶),发现β-胡萝卜素几乎全部被转化,产生了28.48 mg/L角黄素、3.64mg/L玉米黄质和1.42 mg/L虾青素。虾青素中间产物角黄素的大量积累表明A.aurantiacum的crtZ基因在耶罗维解脂酵母表达能力较弱。本研究首次在耶罗维解脂酵母中实现了角黄素、玉米黄质和虾青素的生物合成。
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【学位授予单位】：上海医药工业研究院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ929

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