植物乳杆菌缓解典型全氟及多氟烷基化合物毒性及机制研究

发布时间：2018-12-20 10:00

【摘要】：全氟及多氟烷基化合物(Per-and polyfluoroalkyl substances,PFASs),是新型持久性有机污染物的一种,以其生物毒性大、化学和热稳定性强、生物难降解、环境分布广等特点,且部分PFASs可通过生物蓄积和食物链在生物体内不断富集,并在人和动物体内广泛检出,所造成的危害己被广泛关注。针对PFASs进入机体后难以排出,通过诱导机体氧化造成机体毒性损伤。而迄今罕有缓解PFASs毒害的临床药物,其中胆汁酸螯合剂存在较大副作用,且安全性和有效性有待系统研究。较于螯合剂方法在中毒后的被动治疗,膳食策略可为PFASs危害前主动地预防提供新解决途径,但目前具有缓解PFASs毒性效果的膳食因子如抗氧化植物化合物等均需较大的摄入量才有效,而大量摄入带来的风险也很难评估。考虑到乳酸菌对黄曲霉毒素、重金属等具有吸附作用,抗氧化性强等优点,使其具备缓解PFASs危害的潜力,但尚未见乳酸菌缓解PFASs毒性的研究。鉴于此,本课题针对典型PFASs—全氟辛酸(Perfluorooctanoate,PFOA)和全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate,PFOS)的危害,发展快速、准确筛选高抗氧化性乳酸菌的细胞抗氧化模型,并将有应用潜力的乳酸菌通过动物模型验证其功能并研究其作用机制。主要结果如下:首先发展细胞抗氧化方法(Cellular antioxidant activity,CAA)评价乳酸菌抗氧化活性,通过比较不同浓度(107、108和109 CFU/m L)下乳酸菌菌株的抗氧化活性,发现109 CFU/m L乳酸菌菌株的CAA活性高于107和108 CFU/m L。并将CAA与4种常见的乳酸菌抗氧化活性评价方法:DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性、还原能力、抑制脂质过氧化活性进行比较,结果表明CAA与4种化学方法得到的结果是一致的。由于CAA是在细胞水平进行的,比化学方法更接近体内,较适合筛选出体内高抗氧化活性乳酸菌。进一步建立了RAW264.7、Caco-2和EA.hy926细胞模型的CAA活性分析,结果表明3种细胞模型相关性较好,可用于乳酸菌抗氧化活性的分析。然后复筛得到耐受PFOA、PFOS的25株乳酸菌菌株,并分析菌株对PFOA、PFOS的吸附活性、耐酸耐胆盐活性、细胞抗氧化活性以及粘附特性,最终筛选到L.plantarum CCFM738可在pH 3.0,6 h内吸附初始浓度50 mg/L的PFOA 49.40%±1.5%,并有很高的细胞抗氧化活性(11.89±1.1μM Quercetin),具有潜在缓解PFOA毒性的可能。而L.plantarum CCFM737可在pH 7.0,6 h内吸附初始浓度为50 mg/L的PFOS 60.00%±1.5%,并有很强的细胞抗氧化活性(9.87±0.98μM Quercetin),具有潜在缓解PFOS毒性的可能。进一步研究了L.plantarum CCFM738对PFOA,L.plantarum CCFM737对PFOS的吸附特性,探究了时间、pH对菌株吸附PFOA、PFOS的影响。系统研究了PFOA、PFOS对C57BL/6J雄性小鼠的急性和亚慢性毒性。结果发现PFOA、PFOS对小鼠的半数致死剂量(LD50)分别为0.457 g/kg BW和0.579 g/kg BW。在PFOA的亚慢性毒性实验中,小鼠连续30天灌胃0.075、0.15和0.3 g PFOA/kg BW,结果造模组与对照组相比,造模组PFOA小鼠的食物摄入量、体重、肾脏比和脾脏比明显降低(p0.05),肝脏比明显增加(p0.05)。病理学观察发现肝脏和肾脏有明显的损害,而脾脏有轻微出血现象。PFOA造模组结果表明小鼠血液生化指标、尿液相关指标、氧化应激参数以及组织病理学发生明显改变。小鼠暴露于PFOS 30天(2.5、5和10 mg PFOS/kg BW/day),打乱了小鼠抗氧化代谢系统,诱导肝脏细胞凋亡,引起肝脏损伤,最终小鼠肝脏增大、重量增加,明确了PFOS对小鼠的肝脏毒性;与肝脏的明显变化相比,肾脏的大小、肾脏损伤的标记物,以及肾脏组织切片观察均无明显变化。建立饲喂L.plantarum CCFM738对急性PFOA暴露小鼠毒性的缓解效果。相比于急性PFOA暴露造模组小鼠,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)活性降低、抗氧化酶活性增加、血清酶活降低、炎症因子抑制、病理学改变减弱,都表明CCFM738可以缓解PFOA造成的肝脏损伤。分别设立预防组和治疗组,发现治疗组效果低于预防组,原因在于,治疗组缓解肾脏损伤作用较弱,并改善小鼠氧化损伤较小,因此对于PFOA造成的急性损伤修复能力低于预防组。相比于急性PFOS造模组小鼠,饲喂CCFM737(1×109 CFU/天)能显著降低小鼠的肝脏体重指数,提高小鼠粪便PFOS含量、降低肝脏PFOS含量、恢复PFOS暴露导致的氧化应激相关指标的变化,并减轻急性PFOS毒性导致的组织病理损伤。然而CCFM737干预的预防组和治疗组对于尿液中PFOS含量无明显改变,这也表明CCFM737缓解PFOS损伤的靶点在于肝脏,而对于肾脏的缓解作用较弱。通过研究PFOA对小鼠亚慢性毒性,阐明PFOA的毒性机制。一方面是升高的MDA活性引发脂质过氧化,从而导致酰基辅酶A氧化酶(Palmitoyl CoA oxidase,ACOX)活性显著增加,使得机体过氧化酶体增加,从而导致机体抗氧化酶活性降低,ROS产生,造成机体肝脏损伤。另一方面是通过过氧化物酶体增殖,从而造成小鼠脾脏的萎缩,小鼠免疫能力改变,血清细胞因子的改变。而且PFOA亚慢性预防组和治疗组的造模症状是不同的,PFOA造模引起的预防组的肾脏比重和脾脏比重显著高于治疗组。而且在PFOA亚慢性毒性暴露中,预防组会造成小鼠肝脏、肾脏损伤,而治疗组未能造成小鼠肾脏损伤。但相较于PFOA亚慢性造模组,乳酸菌CCFM738明显的降低了MDA活性,降低了升高的ACOX活性,而且加上乳酸菌的的吸附作用,使得其明显的改善了PFOA亚慢性暴露引起的肝脏损伤(升高的血清酶活)、肾脏损伤、以及脾脏萎缩引起的免疫损伤。PFOS亚慢性毒性与PFOA相似的是均可以通过升高MDA活性,诱导脂质过氧化,进一步导致ACOX活性显著提高,使得机体损伤,不同的是PFOS亚慢性毒性会上调MAPKs信号通路相关激酶表达量,从而导致细胞凋亡,但是PFOS未能造成肾脏损伤。CCFM737除了与CCFM738同样具有抗氧化功效以外,它还可以调节Nrf2表达量,从而促使机体产生氧化应激,这说明CCFM737在缓解PFOS造成的氧化损伤方面表现出比槲皮素更好的效果。
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【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS201.3

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