基于适配体识别—化学发光功能化纳米探针的食品安全危害因子检测方法研究

发布时间：2019-01-07 17:39

【摘要】：化学发光功能化纳米材料可以将纳米材料独特的光学、磁学和催化等性能与化学发光的优点相融合,不但可以起到增强化学发光检测体系灵敏度的作用,还可以赋予纳米材料化学发光性能,对于生物、医药领域和食品安全检测领域都具有重要意义。适配体具有特异性好、靶标范围广、易于生物化学修饰等特点。作为一种新型的分子识别元件,适配体在食品安全检测领域的应用越来越广泛。抗生素残留和食源性致病菌污染在我国甚至全世界广泛存在,是引发食品安全问题的重要因素,因此,抗生素和食源性致病菌是食品安全危害因子检测的重要指标。论文研究了基于适配体识别的新型化学发光功能化纳米探针在抗生素和食源性致病菌检测中的应用,结合磁分离富集技术、滚环扩增技术等建立了快速、灵敏、可靠的新型分析检测方法,为丰富和提高食品安全技术提供了新思路。第一,通过壳聚糖和N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)共同还原氯金酸获得分散均匀和发光性能良好的ABEI功能化花状纳米金。随后通过引入对碘苯酚(PIP)构建了ABEI功能化花状纳米金-H2O2-PIP稳态化学发光体系,使鲁米诺类的化学发光反应类型由瞬时发光变成稳态发光,并可使稳态化学发光检测时间延长至20 min,为后续化学发光检测体系的构建奠定基础。第二,研究了ABEI功能化花状纳米金结合磁分离富集技术与适配体识别技术在单组分抗生素检测中的应用。将适配体与磁性Fe_3O_4纳米颗粒连接组装成捕获探针,将适配体互补序列与ABEI功能化花状纳米金连接组装成信号探针,当目标物存在时,目标物及互补序列可以与适配体发生竞争性结合,通过磁分离可以得到磁性Fe_3O_4纳米颗粒与信号探针的复合物,在加入H2O2和PIP后可测定化学发光信号,进而可以得到目标物浓度。以氯霉素作为分析物质,构建基于ABEI功能化花状纳米金标记-适配体识别-磁分离富集的高灵敏度、高特异性检测方法,在0.01-0.2 ng/mL浓度范围内呈良好线性关系,检测限为0.01 ng/mL,实际样品加标回收率在94.8%-103.1%之间,表示所构建方法可应用于牛奶样品中氯霉素的检测。第三,在ABEI功能化花状纳米金成功实现单组分检测的基础上,初步探究以ABEI功能化花状纳米金作为化学发光标记物在多组分检测中的应用。以96孔微孔板作为固相载体,以三种抗生素作为分析模型,将三种适配体序列通过亲和素固定在微孔板上,将三种目标物适配体互补序列分别与ABEI功能化花状纳米金连接组装成信号探针,构建竞争反应模型,实现对土霉素、四环素和卡那霉素的同时检测,其检测线性范围分别为0.05-5 ng/mL、0.05-5 ng/m L以及0.005-0.5 ng/m L,检测限分别为0.02 ng/mL、0.02ng/m L以及0.002 ng/mL。实际样品加标回收率在96.04%-102.66%之间,表示所构建方法可应用于牛奶样品中三种抗生素的检测。第四,构建了基于Co~(2+)增强/ABEI功能化花状纳米金和滚环扩增技术的增敏性化学发光检测体系实现对鼠伤寒沙门氏菌的检测。将适配体与磁性Fe_3O_4纳米颗粒连接而组装成捕获探针;将Co~(2+)固定在ABEI功能化花状纳米金表面实现发光信号增强,以滚环扩增产物互补序列与Co~(2+)增强/ABEI功能化花状纳米金连接组装成信号探针。以鼠伤寒沙门氏菌为检测模型,在目标菌存在时,通过适配体与目标菌的特异性结合以及碱基互补配对可以形成“捕获探针-目标菌-滚环扩增产物(信号探针)”三明治夹心结构,通过测定体系的化学发光强度可以实现对鼠伤寒沙门氏菌的高灵敏、高特异性检测。在目标菌浓度为32-3.2×106 cfu/m L时,体系化学发光强度的变化与鼠伤寒沙门氏菌浓度的对数呈良好线性关系,检测限为10 cfu/mL。本检测方法与平板计数法得到的检测结果一致性良好,说明所构建的方法可成功用于猪肉样品中鼠伤寒沙门氏菌的检测。第五,研究了Co~(2+)增强/ABEI功能化花状纳米金作为能量供体在化学发光共振能量转移体系中的应用,构建了均相化学发光检测体系。以互补序列与Co~(2+)增强/ABEI功能化花状纳米金连接后的复合物作为能量供体,以WS2纳米片作为能量受体,以适配体作为识别分子,并结合滚环扩增技术构建了化学发光共振能量转移体系,根据WS2纳米片对DNA单链和双链结合能力的差异实现对金黄色葡萄球菌的检测。通过测定体系的化学发光强度可以实现对金黄色葡萄球菌的高灵敏度、高特异性检测。在50-1.5×105 cfu/mL浓度范围内,体系化学发光强度的变化与金黄色葡萄球菌浓度的对数呈现良好的线性关系,检测限为15 cfu/m L。本检测方法与平板计数法得到的检测结果一致性良好,说明所构建的检测体系已成功用于猪肉样品中金黄色葡萄球菌的检测。本论文制备了ABEI功能化花状纳米金这一种化学发光功能化纳米材料,利用其优良的化学发光性能与生物修饰性能,结合适配体识别技术、滚环扩增技术,构建了一系列基于磁分离富集技术和微孔板分离技术的化学发光检测体系以及均相化学发光共振能量转移体系,实现了对食品危害因子中抗生素和食源性致病菌的单组分或多组分的同时检测,所构建的化学发光检测方法特异性强、灵敏度高、可靠性好,拓展了化学发光检测的应用范围,同时也为食品安全提供了技术保障。
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【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TB383.1;TS207.4

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