黑曲霉发酵生产柠檬酸的关键节点解析及对策

发布时间：2019-01-21 18:58

【摘要】：柠檬酸(2-羟基丙烷-1,2,3-三羧酸,citric acid)来源于三羧酸循环的中间代谢,是一种非常重要的平台化合物,也是当前世界上产量和消费量最大的食用有机酸。黑曲霉发酵淀粉质原料合成柠檬酸是当前的主要生产方式。尽管已成为发酵工业中最重要的大宗发酵产品之一,柠檬酸在其生产过程中仍存在着淀粉质原料液化缺乏科学评价标准、种子培养过程繁琐且不稳定、原料利用不完全及发酵模式能效低等在发酵工业中非常具有代表性的问题。本论文通过解析黑曲霉糖化酶催化效率-糊精分子量之间的关系,建立了基于糊精分子量特征的淀粉质原料液化效果评价方法;依据黑曲霉生理学特性及形态学特征,研究超声预处理孢子及菌丝球分散技术,从而构建了种子循环培养工艺;集成分割发酵技术与菌丝球分散技术策略,建立了分割循环发酵工艺;运用阶段添加糖化酶的手段,保障了葡萄糖供应与消耗速率的匹配,实现了柠檬酸产量及原料利用率的提升。主要研究结果如下:(1)建立了基于糊精分子量特征评价淀粉质原料液化的方法。采用乙醇分级沉淀方法制备分子量分布集中的糊精样品;发酵菌种黑曲霉培养液经分离纯化,获得了电泳纯糖化酶的三个同工酶(Glucoamylase,GM),其中GM I,GM II,GM III亚基分子量分别为30 kDa,50 kDa,100 kDa。基于黑曲霉糖化酶催化与糊精分子量构效关系,建立了基于糊精分子量特征评价淀粉质原料液化水平的方法。液化糊精组分Mw为1.9 kDa时,Km值最小即糖化酶与糊精亲和力最高,液化组分Mw集中在1.4~1.9 kDa范围内,有助于提升后期糖化效率。进一步地,精细化调控了淀粉质原料液化组分,与基于DE值的传统液化评价效果相比,液化糊精更易被糖化酶作用;液化组分用于柠檬酸发酵,柠檬酸合成速率与总糖消耗速率明显改善,发酵周期缩短9 h,残总糖降低10.8%,发酵产率提高21.1%。(2)超声波预处理孢子,促进了孢子水分渗透,加快孢子萌发。依据黑曲霉孢子萌发的生理特性,超声波预处理孢子促进孢子水分渗透,诱导孢子快速萌发,缩短种子培养时间,应用于发酵可使产率提高8.13%。在发酵罐水平上系统研究其整个生命过程中生理学特性及生长动力学参数,发现黑曲霉分泌糖化酶能力能够直观反映种子细胞活力,可以作为移种的特征指标,能有效避免基于种龄的传统移种方式引起发酵菌种活力波动的问题。组合超声波诱导孢子萌发与糖化酶活力表征的移种策略,显著提升了移入发酵的菌种活力,缩短产酸调整期,发酵产率提升11.76%,总发酵时间缩短7.9 h。(3)基于菌丝球分散技术构建了种子循环培养工艺。针对种子传统培养周期长的问题,提出采用菌丝球替代传统孢子接种工艺,有效避免了种子传统培养模式繁琐的问题(批量培养孢子制备超过30 d);在此基础上,采用菌丝球分散技术,突破了种子连续培养中菌丝体结构引起活力下降的瓶颈,构建了种子循环培养工艺,种子循环培养八批次,种子仍然维持较高的活力;循环培养的种子以分散形态接种发酵明显优于菌丝球形态,连续培养八批次,发酵过程稳定,柠檬酸平均产量比菌丝球形态接种提高了26.5%,甚至比初始对照组提高2.5%。(4)集成菌丝球分散技术与分割发酵策略构建了分割循环发酵工艺。分割发酵策略实现菌体生长与柠檬酸合成有效分离,在菌丝球形态的分割循环发酵过程中,菌丝体形态特征限制了菌体生长与柠檬酸积累,通过菌丝球分散技术有效控制分割循环发酵过程中菌丝体形态特征,连续发酵六批次,发酵菌丝球形态稳定,柠檬酸产量由70.3 g·L~( 1)提高至97.0 g·L~( 1),但仍低于对照组;进一步地,在优化的分割发酵条件下(分割比例2/10(v·v 1),限制性氮源供应量15 g·L~( 1),分割时机24 h),分割循环发酵十批次,发酵过程稳定且柠檬酸产量比对照提高了1.26%,总糖消耗量降低10.01%,显著提高了柠檬酸生产效率。(5)阶段添加糖化酶策略,保障了柠檬酸合成期葡萄糖供应速率,改善柠檬酸合成效率。针对发酵残总糖偏高的问题,解析了商品糖化酶与黑曲霉自身分泌的糖化酶pH耐受性,发现商品糖化酶在低pH条件下稳定性更高;提出在发酵开始前预加商品糖化酶糖化2 h(60°C)再进行正常发酵方式,发酵残总糖下降10.4%,生产强度提升了0.11 g·L~( 1)·h~( 1),但发酵初始高浓度葡萄糖抑制细胞生长,发酵中后期糖化酶活力损失严重;进一步地,在发酵过程添加糖化酶,运用阶段添加糖化酶手段,有效补偿了发酵过程中因pH急剧下降导致的酶活力损失,保障葡萄糖供应速率,发酵产率提升13.3%,发酵残糖降低31.3%,简化了后期发酵产物分离与提取工艺。
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【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TQ921.1

【参考文献】