丙烯酰胺致小鼠神经毒性分子机制及蓝莓花色苷提取物对其解毒作用的研究

发布时间：2019-02-12 07:12

【摘要】：丙烯酰胺(acrylamide,AA)是富含碳水化合物的食品在热加工过程中产生的2A类致癌物,职业暴露研究及体内动物实验均表明AA具有神经毒性,并存在潜在的遗传毒性、肝脏毒性等。氧化应激及下游相关通路的激活可能是AA引起体内毒性的机制之一。本研究利用小鼠原代神经胶质细胞模型,探讨了AA造成氧化应激并导致神经毒性的分子机制。进而应用天然抗氧化剂--蓝莓花色昔提取物在昆明小鼠模型上,对AA所引起的氧化应激进行干预,并探讨可能的干预机制。主要的结果及结论如下:(1)通过免疫磁珠分选法,建立了原代星型胶质细胞和小胶质细胞纯培养模型。选取新生48 h内小鼠,断头取脑,除去脑膜及明显血管,过筛后在细胞培养瓶中进行贴壁培养,期间去除少突胶质细胞,待9-14天后星型胶质及小胶质细胞完全成熟,利用特异性抗体CD11+结合磁珠分选的方法,分别获得星型胶质及小胶质细胞纯培养体系,并运用免疫荧光双染法鉴定其纯度,取纯度大于90%的细胞做为后续实验的研究材料。(2)通过MTT染色、测定活性氧自由基(Reactive oxygen species,ROS)含量、还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量及GSH与氧化性谷胱甘肽的比值的测定,分别在星型胶质细胞和小胶质细胞中,对AA染毒剂量进行了筛选。结果表明细胞毒性、自由基含量及GSH的损失都与AA染毒浓度呈正相关。并最终确定O.1mM和1.0mMAA做为后续探究氧化应激相关通路的最适作用浓度。在两种细胞模型上,AA引起的ROS产生了典型的过氧化产物4-羟基壬烯醛和8-羟基脱氧鸟苷,并且进一步促进了 Nrf2及NF-κB转移因子的入核,激活了下游相关通路;其中,Nrf2入核时间早于NF-κB,其下游抗氧化相关基因血红素单加氧酶(HemeOxygenase1,HO1)、NADPH脱氢酶(NAD(P)Hq uinone dehydrogenase 1,NQO1)、谷胱甘肽巯基转移酶(GlutathioneS-transferase,GST)在mRNA和蛋白的表达水平均有显著提高,以抵抗AA所产生的ROS。随着AA染毒时间延长或剂量升高,其抗氧化相关的代偿链崩溃,NF-κB入核激活下游与炎症相关通路,白细胞介素(Interleukin,IL)IL1-β、IL6、肿瘤坏死因子(Tumor necrosisfactor,TNF)TNF-α在细胞上清中被检出,细胞活力下降,最终导致死亡。相比于星型胶质细胞,AA毒性会在小胶质细胞中引起更多ROS蓄积、加速GSH耗竭、加快氧化产物的生成,更快速激活氧化应激相关的Nrf2、NF-κB通路及下游基因,导致细胞死亡率增加。(3)通过MTT染色、测定ROS含量、GSH含量及GSH与氧化性谷胱甘肽的比值在星型胶质/小胶质细胞共培养模型上进行了 AA染毒剂量的筛选,细胞毒性、自由基含量及GSH的损失都与AA浓度呈剂量效应关系。在共培养模型上,高剂量1.0mMAA能够显著提高4-羟基壬烯醛和8-羟基脱氧鸟昔的生成量,并进一步促进Nrf2及NF-κB转移因子入核,进而导致下游相关酶HO1、NQO1、GST/IL1-β、IL6、TNF-α顺次激活。类似于纯培养,Nrf2的入核时间早于NF-κB。不同于两种纯培养模型,共培养Nrf2及NF-κB的激活速率介于两者之间,即快于星型胶质细胞而慢于小胶质细胞。(4)通过对差异表达蛋白的筛选及对比,利用IPA软件对其所影响的经典通路、上游调节元件、蛋白互作网络、主要生物功能进行分析,得出过多ROS的产生,从而导致的细胞氧化损伤是AA介导的神经毒性发生的主要原因之一。并且Nrf2和NF-κB通路可能是受AA毒性影响的主要通路,MAPK等磷酸化通路的改变可能是Nrf2和NF-κB激活的原因。本章蛋白组学结果预测与前两章的实际观测结果吻合。(5)蓝莓花色苷提取物(Blueberry anthocyanins extract,BAE)对AA体内干预的结果表明,50-250 mg/kg b.w./day的BAE能够抑制AA染毒小鼠肝脏线粒体中ROS的产生,恢复线粒体电子传递链复合物以及ATP水解酶酶活,改善线粒体内膜磷脂氧化及阻止膜电位消失,减少细胞色素c外漏并防止线粒体发生肿胀。推测BAE抑制AA所产生的氧化应激与其保护线粒体功能性密切相关。
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【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS201.6

【参考文献】