基于两性离子载体材料的小干扰RNA药物输递体系的研究

发布时间：2017-03-23 12:11

  本文关键词：基于两性离子载体材料的小干扰RNA药物输递体系的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)药物在疾病治疗中具有广泛的应用前景,但是,siRNA药物的自身缺点是其临床应用的最大挑战。目前,常采用PEG修饰的阳离子脂质体进行siRNA药物的递送治疗,以克服siRNA药物治疗中的细胞外和细胞内障碍。然而,PEG修饰严重影响阳离子脂质体对siRNA药物的包埋,降低了阳离子脂质体/siRNA复合物(Lipoplexes)的细胞内吞及内涵体逃逸能力。同时,PEG修饰会引发“加快血液清除”(Accelerated blood clearance, ABC)的免疫反应,严重影响siRNA药物在靶部位的富集和治疗效果。针对以上难题,本文设计了基于两性离子聚合物聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(Poly(carboxybetaine), PCB)的阳离子脂质体siRNA药物输递体系,通过体外和体内实验证明所构建的PCB修饰阳离子脂质体siRNA药物输递体系可以有效地递送siRNA药物至靶细胞,显著提高了siRNA药物的作用效果。论文具体开展的研究工作如下：(1)设计合成了PCB修饰的脂质分子二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-poly(carboxybetaine)n, DSPE-PCBn),用于构建新型长循环阳离子脂质体。其中,DSPE-PCB20在生理条件下可以有效增强阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性,效果与DSPE-PEG 2000相当。同时,由于PCB独特的结构,即PCB分子中含有大量的负电荷羧酸根基团,其在内涵体的酸性条件下可以质子化,增加了阳离子脂质体表面的正电荷,促进阳离子脂质体对负电荷内涵体膜的扰动,从而有利于siRNA药物逃离内涵体进入细胞质发挥基因沉默作用。DSPE-PCB20阳离子脂质体因具有显著的血清稳定性、siRNA药物复合能力和内涵体逃逸能力,其负载针对肝部载脂蛋白B (Apolipoprotein B, ApoB)的siRNA药物可以有效下调ApoB的表达,从而从根源上降低了血液中胆固醇的含量,在治疗高胆固醇血症方面具有很好的应用前景。(2)制备了DSPE-PCB20修饰的新型长循环阳离子脂质体,考察尾静脉注射DSPE-PCB20修饰阳离子脂质体/siRNA复合物是否可以避免ABC现象。与DSPE-PEG2000修饰的阳离子脂质体／siRNA复合物不同,DSPE-PCB20阳离子脂质体/siRNA复合物可以有效避免ABC现象,其两次给药血液清除速率一致,无第二次给药肝脏富集增多的现象产生,从而不影响第二次给药的siRNA药物在肿瘤组织的富集,是同次给药DSPE-PEG 2000组的1.3倍。在细胞水平,PCB修饰可以有效促进siRNA药物的内涵体逃逸能力,使siRNA药物进入细胞质发挥药效。因此,在肿瘤治疗方面,DSPE-PCB20阳离子脂质体负载针对Polo样激酶1(Polo-like kinase 1,Plkl)的siRNA药物siPlk1可以有效沉默目标蛋白Plk1的表达,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长,在肿瘤治疗中具有很好的应用前景。(3)设计合成了PCB修饰的喜树碱(Camptothecin, CPT)前药类脂质分子CPT-PCBn,用于制备双重敏感程序可控释放的阳离子脂质体siRNA药物和CPT化疗药物的联合给药输递体系。实验首先通过酯键连接制备了PCB修饰的CPT前药类脂质分子CPT-PCBn,结合阳离子脂质DDAB,制备CPT-PCBn前药阳离子脂质体siRNA药物输递体系。CPT-PCBn前药阳离子脂质体/siRNA复合物不仅提高了药物的稳定性和载药率,同时具有双重敏感程序可控释放的性质。首先,PCB分子在内涵体酸性条件下质子化,加快siRNA药物的内涵体逃逸,使其在与细胞孵育4h时高效释放进入细胞质。其次,CPT-PCBn勺酯键连接基团具有酸性和酯酶敏感性,在细胞内涵体和细胞质中利用酸性或酯酶响应断裂,12h时持续释放CPT进入细胞核。由于siPlkl首先释放下调Plkl蛋白的表达可以促进HeLa肿瘤细胞对CPT的敏感性,因此,CPT-PCBn前药阳离子脂质体/siPlkl复合物在体外和体内均具有很好的协同肿瘤抑制效果,在肿瘤治疗中具有很好的应用前景。
【关键词】：小干扰RNA 聚羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯 阳离子脂质体 内涵体逃逸 加快血液清除现象
【学位授予单位】：中国科学院研究生院(过程工程研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TQ460.1
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 1 文献综述16-44
• 1.1 引言16
• 1.2 siRNA治疗药物简介16-20
• 1.2.1 siRNA的作用机制16-18
• 1.2.2 siRNA药物分子的研发及应用18-20
• 1.2.3 siRNA药物应用中存在的问题20
• 1.3 siRNA药物的输递体系20-34
• 1.3.1 病毒载体21-23
• 1.3.2 非病毒载体23-34
• 1.3.2.1 阳离子脂质体23-28
• 1.3.2.2 合物28-30
• 1.3.2.3 枝状大分子30-32
• 1.3.2.4 无机纳米载体32-34
• 1.4 siRNA药物输递障碍及解决方法34-38
• 1.4.1 siRNA药物的高效包载34
• 1.4.2 血液稳定性34-35
• 1.4.3 细胞内吞35
• 1.4.4 内涵体逃逸35
• 1.4.5 病因复杂性35
• 1.4.6 PEG在克服输递体系障碍中的应用35-38
• 1.5 两性离子聚合物抗非特异性蛋白吸附材料38-40
• 1.6 立题依据及研究目标40-44
• 1.6.1 论文立题依据40-41
• 1.6.2 论文工作目标41-44
• 2 DSPE-PCB_n修饰的新型长循环阳离子脂质体用于siRNA药物的递送44-74
• 2.1 引言44-45
• 2.2 实验方法45-54
• 2.2.1 实验材料及药品45-46
• 2.2.2 细胞与动物46
• 2.2.3 实验仪器46
• 2.2.4 DSPE-PCB_n脂质分子的合成与表征46-48
• 2.2.5 阳离子脂质体和复合物的制备与表征48-49
• 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳49
• 2.2.7 siRNA药物包埋率的测定49-50
• 2.2.8 DSPE-PCB_n阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性50
• 2.2.9 DSPE-PCB_n阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞毒性50
• 2.2.10 流式细胞仪测定复合物的细胞内吞50
• 2.2.11 激光扫描共聚焦显微镜测定复合物的细胞内吞和内涵体逃逸50-51
• 2.2.12 IN Cell Analyzer 2000测定复合物的内涵体逃逸能力51
• 2.2.13 DSPE-PCB_n阳离子脂质体/siRNA复合物的pH敏感性测定51
• 2.2.14 荧光共振能力转移实验51-52
• 2.2.15 DSPE-PCB_n阳离子脂质体/siRNA复合物的体外作用效果52
• 2.2.16 DSPE-PCB_n阳离子脂质体/siRNA复合物的生物分布测定52-53
• 2.2.17 DSPE-PCB_n阳离子脂质体/siRNA复合物的体内作用效果53
• 2.2.18 数据分析53-54
• 2.3 结果与讨论54-71
• 2.3.1 DSPE-PCB_n脂质分子的表征54-55
• 2.3.2 阳离子脂质体和复合物的物理化学表征55-57
• 2.3.3 阳离子脂质体对siRNA药物的复合能力57-59
• 2.3.4 DSPE-PCB_n阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性59-60
• 2.3.5 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的生物相容性60-61
• 2.3.6 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞内吞61-63
• 2.3.7 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的内涵体逃逸能力63-66
• 2.3.8 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的酸性敏感性66-67
• 2.3.9 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的内涵体膜扰动能力67-68
• 2.3.10 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的体外基因沉默效果68-69
• 2.3.11 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的体内生物分布69-70
• 2.3.12 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的体内作用效果70-71
• 2.4 本章小结71-74
• 3 避免ABC现象的DSPE-PCB_n长循环阳离子脂质体用于肿瘤治疗74-104
• 3.1 引言74-75
• 3.2 实验材料与方法75-84
• 3.2.1 实验试剂75-76
• 3.2.2 细胞与动物76
• 3.2.3 实验仪器76
• 3.2.4 阳离子脂质体和复合物的制备与表征76-77
• 3.2.5 siRNA药物包埋率的测定77
• 3.2.6 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性77
• 3.2.7 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞毒性77-78
• 3.2.8 流式细胞仪测定复合物的入胞能力和机制78
• 3.2.9 阳离子脂质体/siRNA复合物的内涵体逃逸能力测定78-79
• 3.2.10 定量siRNA药物的细胞内释放79
• 3.2.11 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的pH敏感性测定79
• 3.2.12 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的药物动力学79-80
• 3.2.13 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的脏器分布80-81
• 3.2.14 血液中IgM和IgG蛋白的测定81-82
• 3.2.15 阳离子脂质体/siRNA复合物的肿瘤分布82-83
• 3.2.16 阳离子脂质体/siRNA复合物的肿瘤抑制效果83-84
• 3.2.17 数据分析84
• 3.3 结果与分析84-102
• 3.3.1 阳离子脂质体及复合物的表征84-87
• 3.3.2 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性87-88
• 3.3.3 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞毒性88-89
• 3.3.4 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的药物动力学性质89-90
• 3.3.5 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的肝、脾脏分布90-91
• 3.3.6 血浆中IgM和IgG蛋白浓度变化水平测定91-93
• 3.3.7 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的肿瘤分布93-96
• 3.3.8 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的肿瘤细胞内吞作用96-97
• 3.3.9 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的内涵体逃逸97-99
• 3.3.10 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物的体内肿瘤抑制效果99-100
• 3.3.11 DSPE-PCB_(20)阳离子脂质体/siRNA复合物靶基因沉默效果100-101
• 3.3.12 TUNEL肿瘤组织细胞凋亡检测101-102
• 3.4 本章小结102-104
• 4 程序释放CPT-PCB_n前药脂质体siRNA药物输递体系用于肿瘤治疗104-146
• 4.1 引言104-106
• 4.2 实验仪器与方法106-117
• 4.2.1 实验材料与药品106-107
• 4.2.2 细胞与动物107
• 4.2.3 实验仪器107
• 4.2.4 CPT-PCB_n类脂质分子的合成与表征107-110
• 4.2.5 临界胶束浓度的测定110-111
• 4.2.6 CPT-PCB_n阳离子脂质体及复合物的制备与表征111
• 4.2.7 CPT及siRNA药物包埋率和载药率的测定111-112
• 4.2.8 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性112
• 4.2.9 CPT的药物释放112
• 4.2.10 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的pH敏感性112-113
• 4.2.11 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞内吞能力和机制113
• 4.2.12 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的内涵体逃逸113-114
• 4.2.13 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞内药物释放114
• 4.2.14 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的靶基因沉默效果114
• 4.2.15 测定CPT阳离子脂质体/siRNA复合物诱导细胞凋亡能力114
• 4.2.16 测定CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞毒性114-115
• 4.2.17 CPT的药物动力学测定115
• 4.2.18 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的生物分布测定115-116
• 4.2.19 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的肿瘤抑制效果116-117
• 4.2.20 数据分析117
• 4.3 结果与分析117-144
• 4.3.1 CPT-PCBn类脂质分子的表征117-121
• 4.3.2 CPT-PCB_n质分子的临界胶束浓度121
• 4.3.3 CPT阳离子脂质体及复合物的物理化学表征121-125
• 4.3.4 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的血清稳定性125-126
• 4.3.5 CPT在不同环境中的药物释放126-127
• 4.3.6 PCB和PMPC修饰复合物的质子缓冲能力127-128
• 4.3.7 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞内吞和机制128-131
• 4.3.8 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的内涵体逃逸131-134
• 4.3.9 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞内药物释放134
• 4.3.10 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞水平基因沉默效果134-136
• 4.3.11 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的细胞水平抑制效果136-138
• 4.3.12 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的药物动力学和生物分布138-141
• 4.3.13 CPT阳离子脂质体/siRNA复合物的体内肿瘤抑制效果141-144
• 4.4 本章小结144-146
• 5 结论和展望146-150
• 5.1 引言146
• 5.2 主要结论146-148
• 5.3 创新点总结148
• 5.4 今后的工作建议148-150
• 参考文献150-162
• 主要符号表162-164
• 个人简历及发表文章目录164-166
• 致谢166

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本文编号：263691