快速检测土壤中酞酸酯的免疫分析技术研究

发布时间：2017-03-28 05:00

  本文关键词：快速检测土壤中酞酸酯的免疫分析技术研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：酞酸酯(PAEs)又名邻苯二甲酸酯,作为增塑剂被广泛应用于工业生产和塑料制品中,具有持久性有机污染物(POPs)的特性,广泛存在于大气、水、土壤和生物等环境中。PAEs是环境内分泌干扰物,进入动物体内会产生类雌激素作用,阻止与动物生殖和发育有关的激素的合成、分泌、贮存、运输、结合和清除等过程,干扰血液维持正常的激素水平,具有致癌性、致畸性和致突变性。1977年,美国环保署(USEPA)将6种PAEs类化合物列入重点控制污染物名单,包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DnOP)、邻苯二甲酸丁基苄基酯(BBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(DEHP);20世纪80年代,我国也将DMP、DBP、DnOP列入环境优先污染物黑名单。我国是设施农业种植面积最大的国家,设施模式以塑料大棚和地膜覆盖为主。PAEs能够从农膜中释放进入土壤,加之破碎和废弃的农膜能够在土壤中长期存在,不仅破坏土壤结构、退化土壤功能,还会通过作物吸收影响农产品安全,危害人体健康。因此,准确测定土壤中PAEs的含量,对于保护农业生态环境、保证农产品安全和保护人体健康都具有十分重要的意义。PAEs的测定方法在早期主要有比色法、滴定法和分光光度法等,但这些方法的灵敏度低,选择性差。目前,一些仪器分析技术被应用于PAEs检测,主要包括气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)和液相色谱-质谱联用法(LC-MS)等。尽管仪器分析法的灵敏度和精密度高,但是它们存在样品前处理复杂、操作繁琐耗时、仪器昂贵和不能在线连续分析等问题,迫切需要发展简便、快速、灵敏、可靠的检测技术。近年来,基于抗原-抗体特异性反应的免疫分析方法成为研究热点。以固相载体吸附抗原-抗体为基础的酶联免疫分析法(ELISA),不需要昂贵的仪器,具有特ii异性强、灵敏度高、简便快捷等特点,在现场筛选和大量样本的快速检测中显示出独特优势,已广泛应用于临床诊断、药物筛选和环境分析与监测等领域。针对paes的免疫检测,目前国内外已经开展了一些研究工作,建立了时间分辨荧光免疫分析法、直接竞争elisa法、竞争荧光免疫法和间接竞争elisa法,但是这些方法的线性范围较窄、灵敏度较低,制备的抗体只能识别单一paes,难以满足同时检测环境中多种paes的实际需要。为此,本文以美国环保署优先监测的6种paes、增塑剂中常用的邻苯二甲酸二环己酯(dchp)和邻苯二甲酸二壬酯(dnp)为检测对象,基于paes类化合物的共性结构特征,设计并合成了2种半抗原,制备免疫原和包被原,研制抗paes的特异性抗体,建立检测paes的间接竞争酶联免疫吸附分析法(ic-elisa)和光纤免疫传感技术,并成功应用于设施菜地土壤中paes的快速灵敏检测,取得了如下主要研究成果:1.以4-硝基邻苯二甲酸为起始化合物,经过酯化、还原和酰胺化等反应,成功合成了检测paes的2种半抗原(i和ii),研制的人工抗原具有载体蛋白和半抗原的特征吸收峰,初步说明偶联成功。两种免疫原(半抗原i-bsa和半抗原ii-bsa)中蛋白浓度分别为4.28和5.35mg·ml-1,包被原(半抗原i-ova和半抗原ii-ova)中蛋白浓度分别为2.78和2.05mg·ml-1。半抗原i、ii与bsa的结合比分别为11:1和8.5:1,与ova的结合比分别为6.5:1和4:1,通过薄层层析(tlc)、核磁共振氢谱(1hnmr)和质谱表征,说明人工全抗原的成功合成。2.用制备的人工抗原免疫新西兰大白兔,获得从a1和a2兔(以半抗原i-bsa为免疫原)产生的抗体效价分别为1:12800和1:25600,b1和b2兔(以半抗原ii-bsa为免疫原)产生的抗体效价分别为1:12800和1:12800。基于a2兔获得的抗血清效价最高,进一步纯化该抗血清,获得抗体中蛋白含量为2.959mg·ml-1。3.采用ic-elisa法,优化并获得paes的最佳检测条件:包被原浓度和抗血清的稀释倍数分别为0.5μg·ml-1和1:3200,磷酸盐缓冲溶液(pbs)的ph和盐浓度分别为7.4和0.01mol·l-1,酶标二抗稀释度为1:2000,抗原和一抗反应60min,paes标准溶液中甲醇含量为10%。在最佳检测条件下,以paes类化合物的浓度对数值为横坐标,抑制结合率(b/b0)为纵坐标,绘制标准抑制曲线,获得dmp、dep、dbp、dehp、dnop、bbp、dchp和dnp的检出限分别为0.013、0.013、0.012、0.042、0.035、0.021、0.017和0.016μg·l-1,抗体与8种paes的交叉反应率分别为100%、83.84%、76.84%、35.77%、39.22%、44.01%、16.69%和26.51%,表明该抗体具有较宽的识别范围;对dmp的ic50为17.12μg·l-1,线性范围为0.08~363.9μg·l-1。对空白土壤样品进行加标回收实验,在加标水平为5、10和100μg·kg-1时,获得的平均回收率为63.9%~103.6%,rsd11.32%;gc-ms法的平均回收率为68.3%~101.4%,rsd10.39%,两种方法取得了一致的结果。建立的ic-ELISA法拓展了PAEs检测的线性范围,检出限明显降低,简化了样品前处理步骤,测定时间仅需4.5 h,并成功应用于设施菜地土壤中PAEs的检测。4.构建光纤倏逝波免疫传感器,用Cy5.5 NHS酯标记抗体,优化并获得PAEs的最佳检测条件:包被原浓度为50μg·m L-1,PBS溶液的pH和盐浓度分别为7.4和0.01 mol·L-1,PAEs-抗体预反应时间为5 min。在最佳检测条件下,以PAEs类化合物的浓度对数值为横坐标,抑制结合率为纵坐标,绘制标准抑制曲线,获得DMP、DEP、DBP、DEHP、DnOP、BBP、DCHP和DNP的检出限分别为0.147、0.153、0.148、0.342、0.337、0.285、0.317和0.156μg·L-1,抗体与8种PAEs的交叉反应率分别为100%、71.94%、62.66%、31.14%、51.8%、42.85%、16.63%和22.75%;对DMP的IC50为9.54μg·L-1,线性范围为0.22~145μg·L-1。传感器具有良好的稳定性和再生性能,使用相同浓度的标记抗体,探头进行60次检测,响应信号没有明显下降。对空白土壤样品进行加标回收实验,在加标水平为5、10和100μg·kg-1时,获得的平均回收率为61.5%~106.7%,RSD13.41%;GC-MS法的平均回收率为66.1%~104.5%,RSD11.63%,两种方法取得了一致的结果。建立的光纤免疫传感检测技术具有较宽的线性范围和较高的灵敏度,样品仅需简单提取,在15min内完成测试,并成功应用于设施菜地土壤中PAEs的检测。
【关键词】：酞酸酯 人工抗原 多克隆抗体 酶联免疫分析 光纤免疫传感器 设施农业土壤
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X833
【目录】：

• 摘要9-12
• Abstract12-16
• 第一章 文献综述16-32
• 1.1 概述16-19
• 1.1.1 PAEs的理化性质16-18
• 1.1.2 PAEs的来源及用途18
• 1.1.3 PAEs的毒性18-19
• 1.2 PAEs的污染途径19-20
• 1.2.1 增塑剂19-20
• 1.2.2 化妆品20
• 1.2.3 涂料20
• 1.2.4 有机树脂废物20
• 1.3 PAEs污染现状20-23
• 1.3.1 大气中的PAEs20-21
• 1.3.2 水体中的PAEs21
• 1.3.3 土壤和沉积物中的PAEs21-23
• 1.3.4 生物及食品中的PAEs23
• 1.4 PAEs的测定方法23-26
• 1.4.1 分光光度法23-24
• 1.4.2 气相色谱法24
• 1.4.3 高效液相色谱法24
• 1.4.4 气相色谱-质谱联用技术24-25
• 1.4.5 液相色谱-质谱联用技术25
• 1.4.6 免疫分析技术25-26
• 1.5 酶联免疫分析技术26-28
• 1.5.1 酶联免疫分析法的基本原理26
• 1.5.2 酶联免疫分析法的常见类型26-27
• 1.5.3 酶联免疫分析法在检测小分子化合物中的应用27-28
• 1.6 光纤免疫传感检测技术28-31
• 1.6.1 光纤倏逝波免疫传感器的检测原理29
• 1.6.2 光纤倏逝波生物传感器的分类29-30
• 1.6.3 光纤倏逝波免疫传感器在环境检测中的应用30-31
• 1.7 总结与展望31-32
• 第二章 引言32-38
• 2.1 选题依据32-33
• 2.2 研究内容33-34
• 2.2.1 PAEs半抗原和人工抗原的合成与表征33
• 2.2.2 PAEs多克隆抗体的制备与鉴定33
• 2.2.3 间接竞争酶联免疫吸附法测定PAEs33-34
• 2.2.4 光纤免疫传感技术测定PAEs34
• 2.3 本研究的意义34
• 2.4 技术路线34-36
• 2.5 研究目标36-38
• 第三章 检测酞酸酯半抗原和人工抗原的合成38-50
• 3.1 材料与方法38-40
• 3.1.1 主要试剂与材料38-39
• 3.1.2 试液配制39
• 3.1.3 主要仪器39-40
• 3.2 实验步骤与方法40-43
• 3.2.1 半抗原的制备40-42
• 3.2.2 人工抗原的合成42
• 3.2.3 测定偶联物中的蛋白含量42
• 3.2.4 计算偶联物结合比42-43
• 3.3 结果与讨论43-48
• 3.3.1 半抗原的鉴定43-46
• 3.3.2 偶联物的紫外光谱46
• 3.3.3 偶联物中的蛋白含量46-48
• 3.3.4 偶联物结合比48
• 3.4 本章小结48-50
• 第四章 检测酞酸酯多克隆抗体的制备与鉴定50-56
• 4.1 材料与方法50-52
• 4.1.1 主要试剂50-51
• 4.1.2 试液配制51-52
• 4.1.3 仪器52
• 4.2 实验步骤与方法52-54
• 4.2.1 抗血清的制备52-53
• 4.2.2 多克隆抗体的纯化53
• 4.2.3 多克隆抗体效价的测定53-54
• 4.3 结果与讨论54-55
• 4.3.1 抗体的效价54-55
• 4.3.2 抗体中的蛋白含量55
• 4.4 本章小结55-56
• 第五章 间接竞争酶联免疫吸附法测定酞酸酯56-70
• 5.1 主要试剂与仪器57
• 5.1.1 主要试剂与材料57
• 5.1.2 试液配制57
• 5.1.3 主要仪器57
• 5.2 GC-MS测定条件57
• 5.3 实验步骤与方法57-60
• 5.3.1 间接竞争ELISA法检测条件的优化57-58
• 5.3.2 间接竞争ELISA法的标准抑制曲线58
• 5.3.3 抗体特异性58-59
• 5.3.4 土壤样品的采集与处理59
• 5.3.5 加标回收实验59
• 5.3.6 设施菜地土壤中PAEs的测定59-60
• 5.4 结果与讨论60-67
• 5.4.1 间接竞争ELISA法的检测条件60-63
• 5.4.2 间接竞争ELISA法的标准抑制曲线63-64
• 5.4.3 抗体的特异性64-66
• 5.4.4 加标回收率66-67
• 5.4.5 设施菜地土壤中PAEs的测定67
• 5.5 本章小结67-70
• 第六章 光纤免疫传感器检测酞酸酯70-84
• 6.1 主要试剂与仪器70-71
• 6.1.1 主要试剂与材料70-71
• 6.1.2 试液配制71
• 6.1.3 主要仪器71
• 6.2 实验步骤与方法71-74
• 6.2.1 光纤免疫传感器的构建71-72
• 6.2.2 光纤探头的制作、清洗与修饰72-73
• 6.2.3 抗体的荧光标记73
• 6.2.4 光纤免疫传感检测73
• 6.2.5 光纤免疫传感检测条件的优化73
• 6.2.6 光纤免疫传感检测的标准抑制曲线73-74
• 6.2.7 抗体特异性74
• 6.2.8 光纤免疫传感器的再生和稳定性74
• 6.2.9 加标回收实验74
• 6.2.10 设施菜地土壤中PAEs的测定74
• 6.3 结果与讨论74-83
• 6.3.1 光纤免疫传感检测条件的优化74-78
• 6.3.2 光纤免疫传感检测的标准抑制曲线78-79
• 6.3.3 抗体的特异性79-81
• 6.3.4 光纤免疫传感器的再生81
• 6.3.5 加标回收率81-82
• 6.3.6 设施菜地土壤中PAEs的测定82-83
• 6.4 本章小结83-84
• 第七章 结论与建议84-86
• 7.1 结论84
• 7.2 主要创新点84-85
• 7.3 建议85-86
• 参考文献86-102
• 致谢102-104
• 攻读博士学位期间的科研成果和参加的科研项目104

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈会明,王超,王星;毛细管气相色谱法测定化妆品中的酞酸酯[J];色谱;2004年03期

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本文编号：271663