柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌抑菌和抗感染作用及其分子机制

发布时间：2020-06-18 12:13

【摘要】：阪崎克罗诺肠杆菌(Cronobacter sakazakii)是一种周生鞭毛、棒状、兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌,能够引起新生儿脑膜炎、坏死性小肠结肠炎和菌血症等疾病,致死率高达50-80%,有效预防和控制阪崎克罗诺肠杆菌对于保障婴幼儿健康具有重要的现实意义,寻求一种安全高效的婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌控制技术方法成为全球研究的热点和难点;阪崎克罗诺肠杆菌污染范围广,婴幼儿配方奶粉是其疫情爆发的主要食物来源,为有效抑制乳粉及其他食品中的阪崎克罗诺肠杆菌,红外、UV辐照及电子束照射等多种技术已被探讨,然而,当前能够控制阪崎克罗诺肠杆菌的方法严重损害乳粉的感官及营养品质,不被消费者广泛接受,因此,探索有效、安全、经济而又不易导致产品品质降低的控制方法及抗感染分子机制,对预防婴幼儿乳粉中阪崎克罗诺肠杆菌的危害具有重要理论价值与重大产业应用潜力;研究发现植物源的某些活性物质在一定浓度下能通过抑制细菌的毒力因子达到抗感染的功效,然而植物源活性物质对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用及抗感染分子机制研究少且缺乏深度,难以支撑产业化应用。因此,本研究在筛查、甄选对阪崎克罗诺肠杆菌有强抑制能力的植物源活性物质柠檬醛的基础上,分别从抑制菌体生长—抑制毒力因子—保护宿主机体三个角度进行了系统研究,重点揭示了柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用机制,对毒力因子、生物膜形成能力及抗群体感应的分子机制,对阪崎诱导的肠细胞炎症反应及动物模型的保护作用,并探究了柠檬醛与温和加热结合对复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌的抑杀作用,具体研究内容及结果如下:1.植物源活性物质对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌活性评价系统筛查、甄别了50种植物源化合物对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌作用,获得了50种植物源化合物对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌圈及最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC),优选获得了植物源高效抑菌剂。试验首先通过牛津杯法,测定了50种植物源活性物质对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌圈直径;随后利用琼脂稀释法,测定了产生抑菌圈的物质对ATCC 29544的MIC;最后,筛选对ATCC 29544的MIC≤5 mg/mL的物质,测定其对4株ATCC标准及5株食品来源分离阪崎克罗诺肠杆菌菌株的MIC。结果表明:40种物质对阪崎克罗诺肠杆菌有可见的抑菌圈,其中7种物质(香芹酚、百里醌、百里酚、肉桂醛、柠檬醛、原儿茶醛和原儿茶酸)的抑菌圈平均直径≥13 mm;40种产生抑菌圈的植物源活性物质中,18种物质对ATCC 29544的MIC≤5 mg/mL。在本研究选取的50种植物源物质中,百里酚和香芹酚对阪崎克罗诺肠杆菌有着最强的抑制作用,对9株阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌浓度均为0.1-0.2mg/ml之间;百里醌、肉桂醛、柠檬醛和原儿茶醛对阪崎克罗诺肠杆菌有良好的抑菌效果,其三者对阪崎克罗诺肠杆菌的mic为0.3-1.25mg/ml;阿魏酸、绿原酸、丁香酸、硫辛酸、原儿茶酸、表儿茶素、咖啡酸、丹皮酚和菊苣酸的mic为2.5-5mg/ml。本章筛选的植物源活性物质柠檬醛为后续的抑制及抗感染分子机制研究奠定了基础。2.柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌的抑制作用机制的研究通过琼脂稀释法检测柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌的最小抑菌浓度并通过液体稀释法测定阪崎克罗诺肠杆菌的生长曲线,应用修正gompertz数学模型拟合其生长曲线并表征生长参数。利用多种荧光探针检测柠檬醛对细菌细胞膜完整性、胞内ph、胞内atp浓度、膜电位的作用,并借助激光共聚焦显微镜及场发射扫描电子显微镜观测柠檬醛对细菌细胞膜完整性及细胞形态的影响。结果表明:柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌的最小抑菌浓度为0.27-0.54mg/ml,并可显著延长阪崎克罗诺肠杆菌的生长延滞期,降低最大生长速率及最大菌体密度;两种检测浓度的柠檬醛(mic和2mic)使细菌胞内ph由6.06降低为5.01和4.84,使细菌胞内atp浓度由0.416μmol/l降低为0.078及0.056μmol/l,使细菌细胞膜完整性分别降低56%和85%,并且使细菌细胞膜电位出现超级化。电镜结果表明柠檬醛使阪崎克罗诺肠杆菌细胞膜完整性显著降低,并改变了菌体形态,使菌体干瘪、皱缩。这些结果说明柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌的抑菌作用可能是通过改变细胞膜的通透性及细胞形态来完成的。3.柠檬醛结合温和加热对复原婴幼儿牛乳中阪崎克罗诺肠杆菌的抑杀作用构建污染复原婴幼儿牛乳模型,探究柠檬醛与温和加热结合对复原婴幼儿牛乳中干燥及非干燥阪崎克罗诺肠杆菌的抑杀作用。将3种阪崎克罗诺肠杆菌的混合菌株(浓度约6.0logcfu/ml)接种于含有不同浓度柠檬醛(0、0.3%、0.6%和0.9%)的复原婴幼儿牛乳样品中,将分别样品置于25°c、45°c、50°c和55°c培养,并在不同的时间点对样品中存活的阪崎克罗诺肠杆菌涂布计数。结果表明:柠檬醛与温和加热结合具有良好的抑菌效果,并且干燥菌体比非干燥菌体对结合作用更加敏感。以上结果说明柠檬醛与温和加热协同作用方法有潜力在婴幼儿乳粉复原过程中使用。4.柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌毒力因子的抑制作用机制探究亚致死浓度的柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌毒力因子的抑制作用。利用含有不同浓度琼脂的半固体培养基,观测柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌泳动及群集运动的影响;借助透射电子显微镜观测柠檬醛对鞭毛形成的影响;通过检测柠檬醛处理后的阪崎克罗诺肠杆菌对人克隆结肠癌腺细胞caco-2粘附及侵入菌量以及在小鼠巨噬细胞系raw264.7的存活和增殖菌量,探究柠檬醛对降低阪崎克罗诺肠杆菌对宿主侵袭力的作用;利用内毒素检测试剂盒探究柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌内毒素产量的影响;通过RT-PCR检测柠檬醛对15个毒力基因的表达影响。结果表明:225μM浓度以下的柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌的生长没有影响,试验选取225μM、112.5μM和56.25μM作为后续探究致病性抑制作用的浓度;亚致死浓度的柠檬醛能够显著降低阪崎克罗诺肠杆菌在半固体培养基上的泳动及群集运动,并使其鞭毛生成量明显减少;柠檬醛能够降低阪崎克罗诺肠杆菌对Caco-2细胞的粘附及侵入的菌量,并可降低其在巨噬细胞RAW 264.7中的存活及增殖的能力;柠檬醛使其内毒素产量显著降低,并使15个毒力相关基因表达量显著下降。这些结果表明,柠檬醛有潜力作为替代品或补充剂减缓由阪崎克罗诺肠杆菌引起的感染。5.柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜及群体感应抑制作用分子机制分别以不锈钢、玻璃、硅胶三种婴幼儿奶瓶常用的材料为生物膜形成的表面,以标准培养基(TSB)和复原婴幼儿配方奶粉(IFB)为培养介质,以12°C、25°C和37°C为生长温度,对阪崎肠杆菌生物膜的形成能力进行系统研究。基于生物膜形成能力及消毒剂清除能力,重点分析柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌生物膜形成的作用及AHL群体感应系统的影响。结果表明:阪崎克罗诺肠杆菌对非生物表面的粘附和生物膜的形成受生长温度,培养基质的影响,12°C阪崎肠杆菌粘附和生物膜形成能力最弱,25°C和37°C生物膜形成周期快,其在TSB中生物膜形成能力强于其在IFB中的能力;阪崎克罗诺肠杆菌生物膜对消毒剂的抗性受培养时间和表面类型的影响;柠檬醛能够抑制阪崎克罗诺肠杆菌在12°C和25°C生物膜的形成能力并显著抑制紫色杆菌ATCC 12472的群体效应信号系统;柠檬醛下调了编码纤维素合成基因(bcsA和bcsG)和群体效应信号系统相关基因(luxR)的表达。这些结果表明,柠檬醛有潜力作为生物膜及群体感应抑制剂应用于食品工业中。6.柠檬醛有效减弱阪崎克罗诺肠杆菌引起的肠道炎症反应分子机制通过构建阪崎克罗诺肠杆菌侵染人小肠上皮细胞Caco-2炎症模型与昆明新生小鼠肠道炎症模型,从细胞及动物模型探究柠檬醛有效减弱阪崎肠杆菌引起的肠道炎症反应而达到保护宿主细胞的分子机制。研究从阪崎克罗诺肠杆菌对肠上皮细胞的细胞凋亡、LDH的释放、NO产生、炎症因子TNF-α的释放、Caspase-3酶活等来揭示柠檬醛的抗炎机理。结果表明10μg/mL的柠檬醛对人肠上皮细胞Caco-2不产生毒性且不影响增殖。在安全浓度范围处理Caco-2细胞,柠檬醛显著降低了细胞的凋亡程度、NO的产生,并降低炎症因子TNF-α的释放及Caspase-3的酶活力从而减弱炎症反应。动物试验结果表明:柠檬醛能保护昆明新生小鼠回肠组织结构,并使TNF-α、IL-1β、iNOS等调控炎症因子基因显著下调,进一步证实了柠檬醛能够提高肠上皮细胞有效抵抗阪崎克罗诺肠杆菌引起炎症反应的能力,进而保护宿主的分子机制。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：TS202.3
【图文】：

8 柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌抑菌和抗感染作用及其分子机制态演变过程(Van Houdt et al. 2005)，大致分为五个阶段：（1）可逆粘附阶段；（2）不可逆粘附阶段；（3）微菌落形成；（4）生物膜成熟阶段；（5）生物膜主动分散阶段(Renneret al. 2011)。不是每个生物膜都会经历所有阶段，其随着环境条件的改变随时变化着。细菌粘附于表面，是生物膜形成的第一步，也是非常必要的一步，是细菌细胞从浮游状态到生物膜模式的转折点。许多物理、化学和生物相互作用促进了细菌的可逆粘附，细菌的鞭毛、菌毛、伞毛对可逆粘附也起到了重要作用，在这个阶段，细菌可以进入生物膜模式或离开表面回到浮游状态；随后细菌细胞分泌胞外聚合物如多糖、蛋白、核酸、脂类等形成生物膜基质使得可逆粘附变得不可逆，此时粘附菌体与固体表面的连接作用较为牢固；此后，生物膜成熟过程开始启动，细菌细胞包裹于胞外基质中形成一个复杂的体系结构，胞外基质作为支架稳定生物膜的三维结构，此结构还包含水通道，便于营养物质的更新和代谢废物的排出；最后，由于营养供应、氧气消耗和其他应力条件的改变，促进分散基因的表达，生物膜从内部开始消散(Abdallah et al. 2014)。

柠檬醛对阪崎克罗诺肠杆菌抑菌和抗感染作用及其分子机制激活，caspase-8 可直接激活 caspase-3；除此之外，caspase-8 还可以激id，后者通过促使 CytoC 的释放引起细胞凋亡的内在途经从而放大凋0)。亡是细胞应对损伤的一个重要的表现(Sarode et al.)。细胞凋亡与细胞亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、的作用。其形态学特征包括染色质凝缩、细胞核片段化以及形成凋亡. 1972)。除了以上形态学的变化，凋亡和涉及一些相关生化过程如磷脂及半胱天冬酶（Caspase）家族的级联激活等(Fink et al. 2005)。

本文编号：2719216