基于组合质谱技术的新型抗结核组合药物临床前药代动力学与代谢相互作用研究

发布时间：2020-07-10 22:51

【摘要】：结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)起的单一致病菌慢性传染性疾病,已成为继HIV/AIDS后世界上威胁人类生命健康的第二大疾病。2013年全球结核病新增发病人数为900万,死亡人数为150万。目前结核病临床治疗多采用联合用药的方式预防耐药结核病的发生,但服用药物多,服药周期长,毒副作用强,成本高是现行主流疗法面临的重大难题。本文基于前期反馈系统控制技术(FSC)对已有抗结核药物进行筛选和组合的基础上,较为全面地研究了新型抗结核组合药物EMB、PZA、CLZ和PRO在SD大鼠和Beagle犬体内的药代动力学特征及体内吸收、代谢方面可能存在的药物相互作用,为新型抗结核组合药物在临床上的应用提供参考数据。一、标准抗结核组合药物定量分析方法的建立和临床前药代动力学研究WHO推荐的标准抗结核组合药物包括RFP、INH、EMB和PZA,文献多采用LC-MS/MS方法进行四个药物的药代动力学研究及其临床治疗药物监测。四个药物极性差别较大,给同时定量测定带来极大困难。本章通过考察不同液相色谱质谱联用仪的适用性,色谱柱的选择,梯度洗脱程序的优化,克服了EMB和INH的基质干扰,建立了一个灵敏度高、特异性好、重现性好的LC-MS/MS方法同时对SD大鼠和Beagle犬血浆中的上述四种药物进行定量分析。血浆样品经乙腈蛋白沉淀后,上清液采用Waters Atlantis dC18色谱柱,以甲醇：乙腈(1：1,v/v)为有机相、0.1%甲酸水溶液为水相进行快速梯度洗脱,四个药物和内标4min内洗脱完全且色谱峰型良好,单个样品分析周期为6mmin。SD大鼠和Beagle犬血浆中上述四种药物定量分析方法学验证结果符合FDA关于生物样品分析的相关规定,该方法被成功地应用于标准抗结核组合药物在SD大鼠和Beagle犬体内的药代动力学研究中。二、新型抗结核组合药物定量分析方法的建立和SD大鼠体内的药代动力学研究本章在前一章分析方法研究的基础上,建立了一个LC-MS/MS方法对新型抗结核组合药物中EMB、PZA、CLZ和PRO同时进行定量分析。20μL血浆样品采用Sirocco96孔蛋白沉淀板进行快速、高通量的分离纯化,随后在Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱上,以甲醇和5mM醋酸铵+0.1%甲酸水溶液为流动相梯度洗脱,四个药物和内标7mmin内洗脱完全且色谱峰型良好,单个样品分析周期为10min。SD大鼠血浆中上述四种药物定量分析方法学验证结果符合FDA关于生物样品分析的相关规定,该方法被成功地应用于新型抗结核组合药物在SD大鼠体内的药代动力学及其相互作用研究中。对比分析SD大鼠单剂量给四个单药和新型抗结核组合药物后四个药物的主要药代动力学参数,发现联合给药后可能会延缓EMB在SD大鼠体内的吸收,促进PRO的吸收,但两者的t1/2和MRT均无明显差异,说明联合给药对大鼠肠吸收转运产生影响,但对药物的消除影响不大。CLZ和PZA的药代动力学参数无明显差异,提示联合给药后对两者无明显药物相互作用。SD大鼠多剂量给药四个单药及其组合药物第五天后,体内四个药物的血药浓度均已基本达到稳态。通过分析对比单剂量和多剂量给四种单药及组合药物后四个药物的药代动力学参数可以看出,连续给药七天后四个药物在SD大鼠体内均有蓄积,但是tmax, t1/2和MRT值无明显差异,说明药物在体内的蓄积不会影响机体代谢特征。三、新型抗结核组合药物在Beagle犬体内的药代动力学研究为了进一步了解新型抗结核组合药物的临床前药代动力学特征,本章沿用第三章的LC-MS/MS法结合Sirocco 96孔蛋白沉淀板样品前处理的方法对新型抗结核组合药物在Beagle犬体内的药代动力学研究和及其相互作用进行考察。通过分析单药和组合药物的单剂量实验后Beagle犬体内四个药物的药代动力学参数,发现联合给药后会延缓机体对EMB的吸收,促进CLZ的吸收,但是对PRO的吸收会有抑制,对PZA无明显影响。多剂量给新型抗结核组合药物第五天开始,Beagle犬体内EMB、PZA和CLZ的血药浓度已基本达到稳态。通过分析单剂量和多剂量给组合药物后四个药物的药代动力学参数,表明连续七天给药后PZA和PRO均无明显的蓄积,药代动力学参数无明显差异,说明连续给药七天不影响PZA和PRO在机体内的药代动力学特征。而EMB和CLZ在Beagle犬体内有明显的蓄积,但tmax,t1/2和MRT值无明显差异,说明这两个药物在Beagle犬体内的蓄积不会影响机体代谢特征。四、新型抗结核组合药物对SD大鼠肝微粒体主要药物代谢酶活性的影响本章采用LC-UV方法对SD大鼠肝微粒体中三种主要药物代谢酶的特异性探针底物非那西丁(CYP1A2)、咪达唑仑(CYP3A4)和氯唑沙宗(CYP2E1)及其主要代谢产物对乙酰氨基酚、1’-羟基咪达唑仑和6-羟基氯唑沙宗进行测定,考察了SD大鼠分别连续给EMB、PZA、CLZ、PRO单药和新型抗结核组合药物14天后对上述三种代谢酶活性的影响。通过与空白组相比发现：对于CYP1A2而言,SD大鼠连续14天给药EMB后对CYP1A2无明显作用,PZA、CLZ、PRO以及组合药物组对CYP1A2存在诱导作用；SD大鼠性别之间没有差异。对于CYP3A4而言,SD大鼠分别连续14天给四个单药以及组合药物后对CYP3A4均无明显作用；但SD大鼠表现出性别差异。对于CYP2E1而言,SD大鼠分别连续14天给药PZA、CLZ、PRO、EMB后对CYP2E1均无明显作用,而组合药物组对CYP2E1存在诱导作用;SD大鼠性别之间没有差异。CYP1A2参与了咖啡因、茶碱等20多种药物的代谢,新型抗结核组合药物临床上如需与这些药物联用时,应特别注意药物疗效及毒副作用。CYP2E1是前致癌物活化的关键酶之一,参与多种疾病的发生,与肝脏毒性密切相关,临床用药时要特别关注患者的不良反应。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R965;O657.63

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