利用重组大肠杆菌和核糖开关进行L-赖氨酸生产的研究

发布时间：2020-09-07 10:09

　　 L-赖氨酸(L-lysine, HO2CCH(NH2)(CH2)4NH2)是一种α-氨基酸,作为人体必需的氨基酸之一,与L-精氨酸和L-组氨酸一样,属于碱性氨基酸,能促进人体发育、增强免疫功能并提高中枢神经组织的功能。在动物饲料中添加L-赖氨酸可以明显改善饲料中氨基酸的营养吸收平衡,促进家畜的健康快速成长。然而由于L-赖氨酸在谷物食品中含量甚低,且在加工过程中易被破坏而导致缺乏,故被称为第一限制性氨基酸。作为一种在食品,医药以及化妆品等行业被广泛使用的添加剂,虽然L-赖氨酸年产量在以非常快的速度增长,但是其需求量也在逐年快速增长,例如2011年,全球L-赖氨酸的产量达到1,650,000吨,而2012年仅用于食品添加剂中的L-赖氨酸产量就超过了1,570,000吨。L-赖氨酸的生产最早主要是依靠化学合成法和蛋白质水解法,但是这些方法存在原料来源有限或者成本较高、生产周期较长、工艺复杂以及环境污染大等缺点,因而逐渐被现代L-赖氨酸产业所淘汰。而生产原材料来源广泛且成本较低、周期较短、工艺易于扩大、环境污染小的微生物直接发酵法生产L-赖氨酸日益得到更加广泛的应用。微生物直接发酵法的最常用原料为制糖工业的废糖蜜、淀粉水解液等非常廉价的糖质原料或者醋酸、乙醇等。微生物发酵法生产L-赖氨酸的主要微生物有谷氨酸棒状杆菌、乳糖发酵短杆菌、黄色短杆菌以及大肠杆菌等。这些发酵菌株主要通过上世纪50年代后期广泛采用的微生物诱变育种以及抗阻遏反馈抑制等技术筛选和选育的。上世纪70年代以来,随着育种技术的进一步发展,一些具有多重遗传性状的突变菌株被选育出来,使发酵工艺逐渐地成熟和完善,L-赖氨酸的产量也得到快速地增长。然而随着近几十年来发酵工业的不断进步,通过传统遗传操作改造所获得的突变菌株,由于遗传背景不清晰,多年传代培养及发酵过程中的非定向进化等原因,造成发酵菌株优秀遗传性状的传递难于控制,菌种的选育和保藏困难,L-赖氨酸产量产率难以保持稳定。由于L-赖氨酸的合成需要多种前体物,生物合成途径中的调控机制比较复杂,传统的遗传操作及育种技术很难进一步提高L-赖氨酸的产量。而且经过数十年的技术积累,目前成熟的L-赖氨酸发酵菌株及其合成代谢途径中的关键酶和基因的序列等都已被欧美日韩等国家申请专利,进一步限制了L-赖氨酸工业的发展。近些年随着代谢工程、比较基因组学、转录组学以及合成生物学的发展,人们对微生物关键代谢物的合成途径及其调控机制的研究得到进一步地深入,通过相关内源基因的过量表达以及外源基因的引入,竞争分支代谢途径的减弱或者消除,转录调控元件的引入以及高通量的定向进化筛选等技术手段,各种合成特定目标化合物的微生物工程菌株被广泛地应用于各种氨基酸、有机酸、生物燃料、萜类化合物以及聚羟基脂肪酸等现代微生物发酵工业中。目前,虽然谷氨酸棒状杆菌在各类发酵中占据主要地位,但是由于大肠杆菌具有遗传背景清晰,遗传操作技术简便成熟,易于培养,生长周期短等优点而越来越多地被代谢工程改造并被用于许多有经济价值的化合物的发酵生产中。针对L-赖氨酸生物合成途径中的诸多限制性因素,本论文首先利用了代谢工程中常用的基因敲除、过表达相关基因、定点突变关键基因以及引入外源基因等技术,对野生型大肠杆菌K-12 MG1655进行了代谢工程改造。通过敲除编码L-赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因,解除了其对细胞内过量积累的L-赖氨酸的降解；敲除了编码磷酸葡萄糖异构酶的pgi基因,从而增加了流向L-赖氨酸合成途径中所需的NADPH:敲除了编码葡萄糖依赖的磷酸葡萄糖转移系统(PTS)中的ptsG基因,从而减少了细胞内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的消耗,为L-赖氨酸的生物合成提供更多的前体；敲除三羧酸循环途径(TCA)中的编码琥珀酰辅酶A合酶的sucC/D基因,从而将TCA循环与L-赖氨酸的生物合成途径相偶联,为后者提供更多了琥珀酰辅酶A；为了进一步提高L-赖氨酸的产量,在低拷贝表达质粒pCL1920上表达了来自于野生型大肠杆菌K-12 MG1655通过定点突变解除了末端产物L-赖氨酸反馈抑制的编码天冬氨酸激酶的lysCfbr基因、编码二氢吡啶甲酸合酶的dapAfbr基因,以及二氨基庚二酸脱羧酶的lysA基因和来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032的编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因,构建了质粒pCLIV,并且转入重组大肠杆菌中构建了L-赖氨酸的基础生产菌株WML001。摇瓶发酵显示该菌株的L-赖氨酸产量可以达到3.89g/L,为进一步的改造提供了基础。作为一门新兴的科学,合成生物学通过分子生物学、基因组学、信息技术和工程学各学科的交叉融合而产生一系列新的工具和方法。通过自然与合成元件的不同组合,来设计、改良、研发甚至制造各种具有特殊功能的生物体。虽然合成生物学与转基因技术存在着一定的交叉,但它是进一步地发展和改善,能够更加高效,便捷地完成传统遗传技术难以完成的任务。核糖开关做为一类位于mRNA5'端非翻译区的顺式作用元件,具有一个配体结合区域,通过专一地与细胞内某些特定的化合物相结合而发生构象的变化,进而影响与之相邻基因的表达,是目前合成生物学中应用非常广泛的一类遗传元件。L-赖氨酸核糖开关是位于大肠杆菌lysC基因5'端上游的一段非翻译序列,当体内L-赖氨酸的浓度较高时,抑制下游基因序列的表达,是一种“抑制型”的核糖开关。将该序列与编码四环素抗性基因以及Ni2+通道蛋白的双重筛选标记tetA基因一同克隆至高拷贝表达载体pUCl 9上,构建L-赖氨酸核糖开关筛选元件。当将该元件转入重组大肠杆菌中,如果宿主菌L-赖氨酸的产量较高,则会通过核糖开关抑制下游tetA基因的表达,减少细胞对Ni2+的摄入,从而可使宿主菌在一定浓度有毒盐离子(Ni2+)的存在下,获得较高的生长速率,而L-赖氨酸产量较低的菌株,则由于tetA基因的表达受到的抑制作用较弱而摄入较多的Ni2+,从而生长速率较慢。本论文通过上述代谢工程技术,得到了L-赖氨酸的基础生产菌株WML001,但是其中起关键作用的天冬氨酸激酶lysCfbr等基因却受到了日本味之素等公司的专利保护,这限制了该菌株在未来的工业化应用,因此本论文根据以前的研究成果采用了未见诸专利的来源于枯草芽孢杆菌天冬氨酸激酶Ⅱ的N末端区域和来自于栖热胞菌天冬氨酸激酶C末端区域的融合酶BT作为该酶的替代。但是将该酶直接应用于L-赖氨酸摇瓶发酵的时候,却发现在重组大肠杆菌的摇瓶发酵产物中几乎检测不到L-赖氨酸。为此,本论文对酶进行了全序列的随机突变,并且利用了L-赖氨酸核糖开关做为工具,最终筛选富集到了三个突变BT酶。与目前发酵工业上广泛采用的来自于大肠杆菌的天冬氨酸激酶lysCfbr基因的相比,这三个突变酶的宿主菌在相同的筛选条件下均表现出了更优异的生长速率。经过三轮的富集筛选过程后,这三个突变酶的宿主菌分别占到了各自培养物菌群比例的72.5%,62.5%以及71.4%,证明L-赖氨酸核糖开关确实可以富集高产L-赖氨酸的有益突变菌；通过将编码这三个突变BT酶的基因(bt1,bt2和bt3),野生型bt,以及天冬氨酸激酶Ⅲ的基因lysCfbr序列克隆至表达载体pET28a中,在大肠杆菌BL21中进行原核表达,发现这几种酶在全细胞SDS凝胶电泳检测中,占可溶性蛋白表达总量的30%左右。在进行酶活检测时,这三个突变酶的酶活分别提高了77%,149%和160%,达到甚至超过了商业生产上广泛使用的lysCfbr基因所编码的天冬氨酸激酶的酶活；而当将这些基因克隆至低拷贝表达质粒pCL1920中,并转入已经在基因组上对dapA(编码二氢吡啶甲酸合酶)进行了解除反馈抑制定点突变的重组大肠杆菌中进行“互补”摇瓶发酵实验检测时,表达这三个突变酶的重组大肠杆菌的L-赖氨酸产量达到甚至超过了商业生产上广泛使用的lysCfbr基因所编码的天冬氨酸激酶。这些结果证明了L-赖氨酸核糖开关可以做为一种简单高效的筛选工具,对L-赖氨酸生物合成途径的关键酶进行定向进化后的筛选,而无需复杂繁琐的检测方法和昂贵的实验仪器。该方法同样也可以对该途径中的其他关键酶,例如二氢吡啶甲酸合酶,进行定向进化后的筛选。本论文首先通过构建L-赖氨酸的基础生产菌株WML001,对L-赖氨酸生物合成途径中的限制性因素进行了研究；以产业化应用为前提,首次将核糖开关这一合成生物学元件引入L-赖氨酸合成途径中关键酶的定向进化后筛选,取得了预期的实验结果。本论文的工作为L-赖氨酸工业化生产的进一步发展提供了重要的研究基础。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：Q93;TQ922
【部分图文】：

示意图,质粒,单克隆,菌落

山东大学博壬学位论文逡逑时至长出清晰的单克隆菌落；逡逑取单克隆菌落划线于新鲜的１００邋＾ｉｇ／ｍＬ的壮观霉素的ＬＢ。直温倒置培养１０到１２小时至长出清晰的单克隆菌落；勒，进行菌落ＰＣＲ检测，对检测大小正确的单克隆进行测序）测序正确的质粒ＰＣＬ１９２０－如沁护少加Ａ－如＾即命名为ｐ

标准曲线,赖氨酸,标准曲线

线性检测范围约为０．５－５％，从而可Ｗ将发酵产物直接用于检测，无需稀释。逡逑取５ｇ／Ｌ、ｌＯｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、４５￡／１＾的以赖氨酸标准溶液，按上述方逡逑法于ＯＤ４７０邋ｎｍ处测定吸光度，并且绘制以赖氨酸检测的标准曲线，如图２－４逡逑所示，吸光度与以赖氨酸浓度在一定浓度范围内呈现线性关系，得到的公式为逡逑ｙ＝２１６．７７ｘ＋３．１６，民２达到０．９９９，可＾文用于一定条件下的发酵液中的以赖氨酸的逡逑检测；但是该方法所检测到的以赖氨酸产量偏高，原因可能是由于发酵样品含逡逑有以赖氨酸的结构类似物等，并且由于所需的心赖氨酸浓度较高，对基本菌株逡逑生产以赖氨酸的检测误差较大。逡逑５０邋－１逡逑ｙ邋＝邋２１６．７７ｘ邋＋邋３ＪＬ＾逡逑４０邋－逦＝逡逑恮邋３０邋－逡逑ｔ邋２。－逡逑３邋１。／逡逑０邋Ｈ逦１逦１逦！逦！逦１逡逑０逦０．０５逦０．１逦０．巧逦０．２逦０．２５逡逑ＯＤ４７０邋ｎｍ逡逑图２－４心赖氨酸标准曲线逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｓｌ；ａｎｄａｒｄ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ逡逑２．３N２柱前衍生法逡逑由于酸性印王酬法测定以赖氨酸的产量数值偏大，并且所需要的以赖氨酸逡逑浓度较高，因此柱前衍生法也逐渐成为测定氨基酸的一种方法，尤其适合所构建逡逑的起始产量较低的以赖氨酸基本生产菌株的检测。该方法测量的氨基酸最大浓逡逑度约为４邋ｇ／Ｌ，若待检测样品中的氨基酸浓度较高时，应该适当稀释后使用。虽逡逑然该方法检测的灵敏度较高

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【共引文献】